वर्तमान†वर्तमान पता: OX11 0DE, यूके, डायमंड बिल्डिंग, हार्वेल साइंस एंड इनोवेशन पार्क, डायटकोट, ऑक्सफोर्डशायर, यूके, डायमंड लाइट सोर्स कं, लिमिटेड, इलेक्ट्रॉनिक जैविक इमेजिंग सेंटर।
प्रतिक्रिया केंद्र प्रकाश-कटाई परिसर 1 (RC-LH1) बैंगनी प्रकाश संश्लेषण घटक छै. हमनें रोडोप्स्यूडोमोनास पैलुस्ट्रिस स॑ आरसी-एलएच1 परिसर केरऽ दू क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संरचना पेश करलकै । आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर केरऽ 2.65-Å रिजोल्यूशन संरचना म॑ आरसी के आसपास 14 सबयूनिट एलएच1 लूप होय छै, जेकरा प्रोटीन डब्ल्यू द्वारा बाधित करलऽ जाय छै, जबकि प्रोटीन-डब्ल्यू के बिना परिसर म॑ आरसी स॑ घिरलऽ पूर्ण रूप स॑ आरसी संरचना होय छै । बंद 16 सबयूनिट LH1 लूप। ई संरचना के तुलना स॑ आरसी-एलएच1 परिसर म॑ क्विनोन के गतिशीलता के बारे म॑ जानकारी मिलै छै, जेकरा म॑ आरसी क्यूबी साइट प॑ क्विनोन क॑ बाइंडिंग करतें समय पहले स॑ अनिर्धारित संरचनात्मक परिवर्तन के साथ-साथ सहायक क्विनोन बाइंडिंग साइट के स्थान भी शामिल छै, जे ओकरा आरसी म॑ पास करै म॑ मदद करै छै । डब्ल्यू प्रोटीन केरऽ विशिष्ट संरचना एलएच१ लूप केरऽ बंद होय स॑ रोकै छै, जेकरा स॑ क्विनोन/क्विनोलोन केरऽ आदान-प्रदान क॑ तेज करै लेली एगो चैनल बनी जाय छै ।
प्रकाश संश्लेषण द्वारा उपलब्ध करायल जाय वाला ऊर्जा पृथ्वी पर लगभग सब जीवन क॑ बरकरार रखै सकै छै, आरू एकरा म॑ सौर जैव प्रौद्योगिकी केरऽ बहुत संभावना छै । वैश्विक प्रकाश संश्लेषण क॑ बढ़ावा दै के साथ-साथ बैंगनी प्रकाशभक्षी बैक्टीरिया विभिन्न ऊर्जा मोड आरू चयापचय क्षमता भी प्रदर्शित करै छै । ई प्रकाश संश्लेषण स॑ बच॑ सकै छै आरू अन्हार म॑ हेटरोट्रोफिक बैक्टीरिया के रूप म॑ बढ़ी सकै छै, नाइट्रोजन आरू कार्बन डाइऑक्साइड क॑ ठीक करी सकै छै, हाइड्रोजन पैदा करी सकै छै आरू सुगंधित यौगिक क॑ अपघटित करी सकै छै (1-3) । ई प्रक्रिया सब लेली ऊर्जा उपलब्ध करै लेली प्रकाश क॑ जल्दी आरू कुशलता स॑ रासायनिक ऊर्जा म॑ बदलना जरूरी छै । ई प्रक्रिया तखन शुरू होय छै जब॑ प्रकाश-फँसै वाला एंटीना परिसर प्रकाश क॑ सोख॑ छै आरू फंसलऽ ऊर्जा क॑ प्रतिक्रिया केंद्र (RC) म॑ स्थानांतरित करी दै छै, जेकरा स॑ आवेश पृथक्करण शुरू होय जाय छै (4 – 7) । बैंगनी प्रकाश संश्लेषण केरऽ मूल इकाई टाइप 2 आरसी स॑ बनलऽ छै, जे प्रकाश-कटाई परिसर १ (एलएच१) स॑ घिरलऽ छै, जेकरा स॑ आरसी-एलएच१ कोर परिसर बन॑ छै । LH1 घुमावदार αβ हेटरोडाइमर केरऽ सरणी द्वारा बनलऽ होय छै, जेकरा म॑ स॑ हर एक दू बैक्टीरियल क्लोरोफिल (BChl) a अणु आरू एक या दू कैरोटीनॉयड (8-12) क॑ बांधै छै । सबसे सरल LH1 एंटीना म॑ 16 या 17 αβ हेटरोडाइमर होय छै जे एक बंद लूप म॑ आरसी (9-13) क॑ घेरने छै, लेकिन अन्य कोर परिसरऽ म॑, ट्रांसमेम्ब्रेन पेप्टाइड आसपास केरऽ LH1 केरऽ निरंतरता क॑ बाधित करै छै, जेकरा स॑ आरसी आरू साइटोक्रोम bc1 परिसर (11, 11) के बीच क्विनोन प्रसार क॑ बढ़ावा मिलै छै । 13-15) के अनुसार। बैंगनी रंग केरऽ फोटोट्रोफिक पौधा रोडोप्स्यूडोमोनास (Rps.) एगो मॉडल जीव छै जे ऊर्जा आरू इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण क॑ समझी सकै छै जे प्रकाश संश्लेषण के समर्थन करै छै । आरपीएस के प्रथम क्रिस्टल संरचना। पैलुस्ट्रिस आरसी-एलएच1 परिसर केरऽ मॉडल आरसी छै, जे 15 हेटरोडाइमेरिक एलएच1 लूप स॑ घिरलऽ छै, जेकरा “प्रोटीन डब्ल्यू” (14) नाम केरऽ एगो अज्ञात प्रोटीन द्वारा बाधित करलऽ जाय छै । बाद म॑ प्रोटीन-डब्ल्यू क॑ आरपीए४४०२ के रूप म॑ पहचानलऽ गेलऽ छेलै, जे तीन भविष्यवाणी करलऽ गेलऽ ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स (टीएमएच) के साथ एक अचरित्र 10.5kDa प्रोटीन छै (16) । हम प्रोटीन डब्ल्यू क॑ एन्कोडिंग करै वाला rpa4402 जीन क॑ pufW म॑ बदलै के प्रस्ताव रखै छियै ताकि आरसी-एल, एम (pufL, pufM) आरू LH1α, β (pufA, pufB) सबयूनिट क॑ एन्कोडिंग करै वाला जीन लेली प्रयोग करलऽ जाय वाला नामकरण के अनुरूप होय सक॑ । दिलचस्प बात ई छै कि प्रोटीन-डब्ल्यू केवल आरसी-एलएच1 के लगभग 10% म॑ ही मौजूद छै, जेकरा स॑ आरपीएस केरऽ खुलासा होय छै । palustris दू अलग-अलग आरसी-एलएच1 परिसर पैदा करै छै. यहाँ, हम दू कोर परिसरऽ के उच्च रिजोल्यूशन क्रायो-ईएम (क्रायो-ईएम) संरचना के रिपोर्ट करय छै, जेकरा म॑ एक प्रोटीन डब्ल्यू आरू 14 αβ हेटरोडाइमर के साथ, दोसरऽ म॑ प्रोटीन डब्ल्यू के बिना आरू एक बंद 16 हेटरोडाइमर एलएच1 लूप छै । हमरऽ संरचना आरपीएस केरऽ आरसी-एलएच1 परिसर केरऽ समझ म॑ एक कदम परिवर्तन के प्रतिनिधित्व करै छै । palustris, कैन्हेंकि हमनें प्रत्येक रूप केरऽ सजातीय आबादी के विश्लेषण करल॑ छै आरू हर पेप्टाइड आरू बाउंड पिगमेंट आरू संबंधित लिपिड आरू क्विनोन क॑ स्पष्ट रूप स॑ असाइन करै लेली पर्याप्त रिजोल्यूशन छै । ई संरचना के तुलना स॑ पता चलै छै कि तीन टीएमएच प्रोटीन-डब्ल्यू जे अभी तलक कोनो भी अन्य आरसी-एलएच1 परिसर म॑ नै मिललऽ छै, वू क्विनोन/क्विनोलोन आदान-प्रदान क॑ तेज करै लेली क्विनोन चैनल पैदा करै छै । संरक्षित लिपिड आरू क्विनोन बाइंडिंग साइट केरऽ संख्या के पहचान करलऽ गेलऽ छै, आरू हमन॑ क्विनोन आरू आरसी के संयोजन के बाद एगो नया संरचनात्मक परिवर्तन के खुलासा करलकै, जे ऑक्सीजनयुक्त फोटोट्रोफिक जीवऽ के फोटोसिस्टम II (पीएसआईआई) आरसी लेली उपयुक्त होय सकै छै । हमरऽ निष्कर्ष बैंगनी फोटोट्रोफिक बैक्टीरिया केरऽ आरसी-एलएच1 कोर परिसर म॑ क्विनोन/क्विनोलोन बाइंडिंग आरू एक्सचेंज के गतिकी के बारे म॑ नया जानकारी प्रदान करै छै ।
आरपीएस मे पाएल गेल दूनू परिसरक कें विस्तृत अध्ययन कें सुविधा कें लेल. palustris, हम जैव रासायनिक विधिय स प्रत्येक आरसी-एलएच1 अलग करय छै. प्रोटीन डब्ल्यू-कमी वाला परिसर (अब स॑ ΔpufW कहलऽ जाय छै) क॑ pufW जीन (16) के कमी वाला तनाव स॑ शुद्ध करलऽ गेलऽ छेलै, आरू केवल एक आरसी-एलएच1 परिसर पैदा करलऽ जाब॑ सकै छै । प्रोटीन डब्ल्यू युक्त परिसर एक तनाव द्वारा उत्पन्न होय ​​छै । ई तनाव केरऽ प्रोटीन डब्ल्यू क॑ ओकरऽ सी-टर्मिनस प॑ 10x His टैग स॑ संशोधित करलऽ जाय छै, ताकि प्रोटीन डब्ल्यू युक्त परिसर क॑ धातु क॑ स्थिर करी क॑ अधिकांश कमी वाला प्रोटीन डब्ल्यू के साथ प्रभावी ढंग स॑ जोड़लऽ जाय सक॑ । परिसर क॑ प्रभावी ढंग स॑ अलग करलऽ जाय छै (16) एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी (IMAC) ।
जैना कि चित्र 1 म॑ दिखालऽ गेलऽ छै, दूनू परिसरऽ म॑ तीन उप-इकाई आरसी (आरसी-एल, आरसी-एम आरू आरसी-एच) होय छै जे एलएच१ एंटीना स॑ घिरलऽ छै । प्रोटीन-डब्ल्यू के कमी वाला परिसर केरऽ 2.80-ए संरचना 16 αβ हेटरोडाइमर दिखाबै छै, जे आरसी क॑ पूरा तरह स॑ घेरने वाला बंद LH1 लूप बनाबै छै, जेकरा बाद म॑ आरसी-एलएच116 परिसर कहलऽ जाय छै । प्रोटीन-डब्ल्यू युक्त परिसर केरऽ 2.65Å संरचना म॑ प्रोटीन-डब्ल्यू द्वारा बाधित 14-हेटरोडाइमर LH1 होय छै, जेकरा बाद म॑ आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कहलऽ जाय छै ।
(A and B) यौगिक के सतह प्रतिनिधित्व। (C and D) छड़ मे व्यक्त बंधित पिगमेंट | (E आरू F) कोशिका द्रव्य सतह स॑ देखलऽ गेलऽ परिसरऽ म॑ पेप्टाइड आरू LH1 सबयूनिट क॑ कार्टून म॑ दर्शायलऽ गेलऽ छै, आरू प्रोटीन-डब्ल्यू गैप स॑ घड़ी के दिशा म॑ नंबर देलऽ जाय छै [आरबीए नंबरिंग के अनुरूप । स्फेरोइड्स परिसर (13)]। LH1-α के लेलऽ प्रोटीन सबयूनिट के रंग पीला होय छै; LH1-β के लेलऽ प्रोटीन सबयूनिट के रंग नीला होय छै; प्रोटीन-डब्ल्यू के लेल, प्रोटीन लाल रंग के होइत अछि; आरसी-एच के लेल, ई सियान अछि; आरसी-एल के लेल, ई ऑरेंज अछि; आरसी-एम, मैजेंटा के लिये। कोफैक्टर क॑ रॉड स॑ दर्शाबै छै, हरियर रंग BChl आरू BPh a अणु क॑ दर्शाबै छै, बैंगनी रंग कैरोटीनॉयड क॑ दर्शाबै छै आरू पीला रंग UQ10 अणु क॑ दर्शाबै छै । (जी आरू एच) आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर (जी) आरू आरसी-एलएच116 परिसर (एच) के समतुल्य क्षेत्र म॑ प्रोटीन-डब्ल्यू अंतराल के आवर्धित दृश्य । कोफैक्टर क॑ स्पेस फिलिंग के रूप म॑ प्रदर्शित करलऽ जाय छै, किलेटेड क्विनोन क॑ नीले रंग म॑ प्रदर्शित करलऽ जाय छै । प्रोटीन-डब्ल्यू अंतराल क॑ (G) म॑ नीली डैश रेखा स॑ उजागर करलऽ गेलऽ छै, आरू छोटऽ छेद जहाँ LH116 रिंग प॑ क्विनोन/क्विनोलोल फैललऽ होय छै, ओकरा (H) म॑ कारी डैश रेखा स॑ हाइलाइट करलऽ गेलऽ छै ।
चित्र 1 (A आरू B) LH1αβ हेटरोडाइमर केरऽ खुला या बंद सरणी स॑ घिरलऽ आरसी क॑ दर्शाबै छै, जेकरा म॑ स॑ हर एक दू BChl आरू एक कैरोटीनॉयड (चित्र 1, C आरू D) क॑ बांधै छै । पिछला अध्ययन स॑ पता चललै छै कि आरपीएस एलएच१ परिसर छै । स्पाइरुलिना ज़ैन्थिन के जैव संश्लेषण मार्ग म॑ ई प्रजाति म॑ कैरोटीनॉयड केरऽ मिश्रित आबादी होय छै ( 17 ). लेकिन स्पाइरोपाइरोक्सैन्थिन प्रमुख कैरोटीनॉयड छै आरू एकरऽ घनत्व संतोषजनक छै । अतः हम सब एलएच 1 बाइंडिंग साइट पर स्पाइरोक्सैन्थिन के मॉडलिंग करब चुनलहुं। अल्फा आरू बीटा पॉलीपेप्टाइड एकल टीएमएच छै जेकरऽ झिल्ली के बाहरी क्षेत्र छोटऽ होय छै (चित्र १, ए, बी, ई, आरू एफ) । हालांकि सी-टर्मिनस प॑ १७ अवशेषऽ के घनत्व नै देखलऽ गेलै, लेकिन अल्फा पॉलीपेप्टाइड क॑ दूनू परिसरऽ म॑ Met1 स॑ Ala46 तलक विच्छेदित करी देलऽ गेलै । β पॉलीपेप्टाइड क॑ आरसी-एलएच116 म॑ Gly4 स॑ Tyr52 म॑, आरू आरसी-एलएच114-डब्ल्यू म॑ Ser5 स॑ Tyr52 म॑ कम करलऽ गेलऽ छेलै । 3 या 4 एन-टर्मिनल या 13 सी-टर्मिनल अवशेषक कें कोनों घनत्व नहि देखल गेलय (चित्र S1)। जंगली प्रकार के तनाव स॑ तैयार मिश्रित आरसी-एलएच१ परिसर केरऽ मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण स॑ पता चललै कि गायब क्षेत्र ई पेप्टाइडऽ के विषम विच्छेदन के परिणाम छेलै (चित्र S1 आरू S2) । α-Met1 केरऽ N-टर्मिनल फॉर्मिलेशन भी देखलऽ गेलऽ छेलै (f) । विश्लेषण स॑ पता चललै कि α-पेप्टाइड म॑ अवशेष fMet1 स॑ Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 तलक शामिल छै, आरू β-पेप्टाइड म॑ अवशेष Ser2 स॑ ल॑ क॑ Ala53 तक शामिल छै, जे कम तापमान वाला ईएम घनत्व मानचित्र स॑ अच्छा सहमति म॑ छै ।
α-His29 आरू β-His36 के समन्वय BChls क॑ आमने-सामने बनाबै छै; प्रत्येक αβ हेटरोडाइमर अपनऽ पड़ोसी के साथ इकट्ठा होय क॑ आरसी के आसपास एक खुला लूप (RC-LH114-W) या एक बंद लूप (RC-LH116) बनाबै छै The exciton coupled pigment array (चित्र 1, C आरू D) । आरसी-एलएच114-डब्ल्यू केरऽ 877 एनएम बैंड के साथ तुलना म॑ आरसी-एलएच116 केरऽ 880 एनएम अवशोषण लाल शिफ्ट 3 एनएम छै (चित्र 2ए) । लेकिन, गोलाकार द्विवर्णता स्पेक्ट्रम लगभग एक जैसनऽ छै (चित्र 2B), जे ई दर्शाबै छै कि यद्यपि खुला आरू बंद लूप के बीच स्पष्ट अंतर छै, लेकिन बीसीएचएल के स्थानीय वातावरण बहुत समान छै । अवशोषण रेडशिफ्ट बंद लूप (18, 19) प॑ तापीय गति म॑ कमी ​​आरू बढ़लऽ स्थिरता, बंद लूप (20, 21) के कारण पिगमेंट युग्मन म॑ बदलाव, या ई दूनू प्रभाव (11) के संयोजन के परिणाम होय सकै छै ।
(A) पराबैंगनी/दृश्यमान/निकट-अवरक्त अवशोषण स्पेक्ट्रम, जेकरऽ चोटी क॑ ओकरऽ संगत पिगमेंट स॑ चिह्नित करलऽ जाय छै आरू 775 एनएम प॑ बीपीएच चोटी प॑ सामान्य करलऽ जाय छै । (B) 805 एनएम पर BChl अवशोषण के लिए सामान्यीकृत परिपत्र द्विवर्णता स्पेक्ट्रम | (सी आरू डी) आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर (सी) आरू आरसी-एलएच116 परिसर (डी) के समय-निर्धारित अवशोषण स्पेक्ट्रा स॑ चयनित ΔA स्पेक्ट्रा । बेहतर तुलनीयता के लेलऽ, सब स्पेक्ट्रा क॑ 0.2 पीएस प॑ −A के ∆A तलक सामान्य करलऽ जाय छै । (E) UQ2 केरऽ विभिन्न सांद्रता केरऽ उपस्थिति म॑ विकिरण के बाद साइटोक्रोम c2 ऑक्सीकरण केरऽ दर (कच्चा आंकड़ऽ के लेलऽ चित्र S8 देखऽ) । (F) कम, मध्यम या उच्च तीव्रता वाला प्रकाश (क्रमशः 10, 30 या 300μMm-2 s-1) के तहत उगय गेलऽ कोशिका म॑, शुद्ध परिसर म॑ प्रोटीन डब्ल्यू आरू आरसी-एल सबयूनिट आरू अलग-अलग झिल्ली अनुपात । एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन आ इम्यूनोएसे (कच्चा आंकड़ा कें लेल चित्र S9 देखू) द्वारा प्रोटीन कें स्तर निर्धारित करूं. शुद्ध आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर के सापेक्ष अनुपात निर्धारित करे | परिसर केरऽ आरसी-एल आरू प्रोटीन-डब्ल्यू केरऽ स्टोइकियोमेट्रिक अनुपात १:१ छै ।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (चित्र 1, ए, सी, आरू ई) केरऽ विकृत αβ14 लूप म॑ स्थिति 1 प॑ बीसीएचएल आरसी-एलएच116 (चित्र 1, बी, डी, आरू एफ, आरू चित्र एस 3) म॑ समकक्ष बीसीएचल्स स॑ 6.8Å आरसी प्राथमिक दाता (पी) के करीब छै; तथापि, दूनू परिसरऽ के क्षणिक अवशोषण गतिकी स॑ पता चलै छै कि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू आरू आरसी-एलएच116 के लेलऽ एलएच1 स॑ आरसी तलक के उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण समय स्थिरांक 40 ±4 आरू 44±3 पीएस छै (चित्र 2) । , सी आ डी, चित्र S4 आ तालिका S2)। आरसी कें भीतर इलेक्ट्रॉनिक स्थानांतरण मे सेहो कोनों महत्वपूर्ण अंतर नहि छै (चित्र एस5 आ संबंधित पूरक पाठ)। हमरा सब क॑ शक छै कि LH1 आरू RC-P के बीच ऊर्जा हस्तांतरण समय केरऽ निकटता के कारण दू LH1 लूप म॑ अधिकांश BChl केरऽ समान दूरी, कोण आरू संभावित ऊर्जा छै । ऐन्हऽ लगै छै कि न्यूनतम दूरी तलक पहुँचै लेली एलएच१ ऊर्जा पैटर्न के खोज करना सबऑप्टिमल साइट स॑ आरसी तलक सीधा ऊर्जा हस्तांतरण स॑ तेज नै छै । आरसी-एलएच114-डब्ल्यू म॑ खुला-लूप LH1 लूप संरचनात्मक विश्लेषण लेली कम तापमान केरऽ परिस्थिति म॑ भी महत्वहीन तापीय गति स॑ गुजर॑ सकै छै, आरू आरसी 1 केरऽ स्थिति प॑ βBChls केरऽ पिगमेंटेशन दूरी स॑ कमरा केरऽ तापमान प॑ एक लंबा αβ14 रिंग संरचना होय छै ।
आरसी-एलएच116 परिसर म॑ ३२ बीसीएचएल आरू १६ कैरोटीनॉयड होय छै, आरू एकरऽ समग्र व्यवस्था वू ही छै जे थर्मोक्रोमैटियम (Tch.) पिडपिडम [प्रोटीन डाटा बैंक (पीडीबी) आईडी ५वाई५एस] (९), थायोरोडोविब्रिओ (Trv.) ९७० तनाव ( पीडीबी आईडी ७सी९आर) (१२) आरू ग्रीन स॑ प्राप्त होय छै शैवाल (Blc.viridis) (पीडीबी आईडी 6ET5) (10)। संरेखण के बाद, αβ हेटरोडाइमर केरऽ स्थिति म॑ केवल छोटऽ विचलन देखलऽ गेलऽ छेलै, खास करी क॑ 1-5, 15, आरू 16 (चित्र S6) । प्रोटीन-डब्ल्यू केरऽ उपस्थिति केरऽ एलएच१ केरऽ संरचना प॑ काफी प्रभाव पड़ै छै । एकरऽ तीन टीएमएच छोटऽ लूपऽ स॑ जुड़लऽ छै, जेकरऽ एन-टर्मिनल परिसर केरऽ लुमेन साइड आरू सी-टर्मिनल साइटोप्लाज्मिक साइड प॑ होय छै (चित्र १ ए आरू ३, ए स॑ डी) । प्रोटीन-डब्ल्यू काफी हद तक हाइड्रोफोबिक (चित्र 3 बी) छै, आरू TMH2 आरू TMH3 LH1αβ-14 के साथ बातचीत करी क॑ एक ट्रांसमेम्ब्रेन सतह बनाबै छै (चित्र 3, बी आरू ई स॑ जी) । अंतरफलक मुख्य रूप स॑ ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र म॑ Phe, Leu आरू Val अवशेष स॑ बनलऽ छै । ई अवशेष हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड आरू αβ-14 पिगमेंट के साथ ढेर होय जाय छै । कुछ ध्रुवीय अवशेष भी अंतःक्रिया म॑ योगदान दै छै, जेकरा म॑ जटिल गुहा के सतह प॑ W-Thr68 आरू β-Trp42 के बीच हाइड्रोजन बंधन भी शामिल छै (चित्र 3, F आरू G) । कोशिका द्रव्य के सतह पर Gln34 αβ-14 कैरोटीनॉयड के कीटो समूह स॑ सटलऽ होय छै । एकरऽ अलावा, n-डोडेसिल β-d-माल्टोसाइड (β-DDM) अणु क॑ हल होय गेलऽ छेलै, आरू एकरऽ हाइड्रोफोबिक पूंछ प्रोटीन-डब्ल्यू आरू αβ-14 के बीच के अंतरफलक तलक फैललऽ छेलै, आरू लिपिड पूंछ शरीर म॑ स्थित होय सकै छै । हमनें ई भी देखलकै कि प्रोटीन डब्ल्यू आरू आरसीएच केरऽ सी-टर्मिनल रिजोल्यूशन क्षेत्र बहुत करीब छै, लेकिन विशिष्ट अंतःक्रिया बनाबै के दायरा म॑ नै छै (चित्र 1, ए आरू ई) । लेकिन, ई दूनू प्रोटीन केरऽ अनसुलझे सी-टर्मिनल अमीनो एसिड म॑ अंतःक्रिया भी होय सकै छै, जे आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर केरऽ असेंबली के दौरान प्रोटीन-डब्ल्यू केरऽ भर्ती लेली एगो तंत्र प्रदान करी सकै छै ।
(A) प्रोटीन-डब्ल्यू, जे कार्टून के रूप म॑ LH1αβ14 के साथ इंटरफेस के सामना करै छै, म॑ एक रॉड के आकार के साइड चेन (लाल) छै, जे इलेक्ट्रोस्टैटिक पोटेंशियल आरेख के एक भाग म॑ प्रदर्शित करलऽ गेलऽ छै (0.13 के समोच्च स्तर के साथ पारदर्शी ग्रे सतह) । (B) प्रोटीन-डब्ल्यू एक हाइड्रोफोबिक रंगीन सतह द्वारा दर्शाया गया | ध्रुवीय आरू आवेशित क्षेत्र क॑ सियान म॑, जलभय क्षेत्र क॑ सफेद रंग म॑, आरू मजबूती स॑ जलभय क्षेत्र क॑ नारंगी रंग म॑ प्रदर्शित करलऽ गेलऽ छै । (C आरू D) कार्टून-W क॑ कार्टून म॑ दर्शायलऽ गेलऽ छै, एकरऽ अभिविन्यास (A) (C) म॑ जैसनऽ छै, आरू 180° (D) स॑ घुमाय देलऽ गेलऽ छै । अनुक्रम म॑ स्थिति के अनुसार भेद करलऽ जाय वाला अवशेष इंद्रधनुषी रंग योजना अपनाबै छै, जहाँ एन-टर्मिनल नीला आरू सी-टर्मिनल लाल होय छै । (E) प्रोटीन-डब्ल्यू (A) के समान दृश्य में, आरू प्रोटीन-W:LH1 के अंतरफलक पर अवशेषों क॑ संलग्न निशान वाला छड़ऽ द्वारा दर्शायलऽ जाय छै । (F) प्रोटीन-डब्ल्यू कार्टून प्रतिनिधित्व म॑ (E) आरू LH1αβ14 के सापेक्ष 90° घुमाय देलऽ जाय छै, आरू बार प्रतिनिधित्व म॑ इंटरफेस अवशेष के सापेक्ष । बीटा पॉलीपेप्टाइड सं ओवरहैंगिंग अवशेषक कें लेबल कैल जायत छै. कोफैक्टर क॑ चित्र १ केरऽ रंग स॑ मेल खाबै वाला बार के रूप म॑ दिखालऽ गेलऽ छै, विघटित β-डीडीएम क॑ ग्रे रंग म॑ दिखालऽ गेलऽ छै, आरू ऑक्सीजन क॑ लाल रंग म॑ दिखालऽ गेलऽ छै । (G) (F) म॑ दृश्य क॑ 180° घुमाय देलऽ जाय छै, जेकरा म॑ लेबल करलऽ गेलऽ अल्फा पॉलीपेप्टाइड केरऽ प्रमुख अवशेष होय छै ।
प्रोटीन-डब्ल्यू एक αβ हेटरोडाइमर (चित्र 1F म॑ 15वां) के जगह लै छै, जेकरा स॑ लूप बंद होय क॑ रोकै छै आरू पहिलऽ तीन αβ हेटरोडाइमर क॑ झुकाबै छै । देखलऽ गेलऽ छेलै कि फिल्म सामान्य के सापेक्ष पहिलऽ αβ-1 हेटरोडाइमर केरऽ अधिकतम झुकाव कोण 25° स॑ 29° (चित्र 1, ए आरू ई) छेलै, जे आरसी ए शार्प कंट्रास्ट-एलएच116 (चित्र 1, बी आरू एफ) म॑ αβ-1 केरऽ 2° स॑ 8° झुकाव स॑ बनलऽ छेलै । दोसरऽ आरू तेसरऽ हेटरोडाइमर क्रमशः १२° स॑ २२° आरू ५° स॑ १०° प॑ झुकलऽ छै । आरसी केरऽ स्टेरिक बाधा के कारण, αβ-1 केरऽ झुकाव म॑ αβ केरऽ दूसरऽ जोड़ी (जे चित्र 1F म॑ 16 वीं αβ स॑ मेल खाबै छै) शामिल नै छै, जेकरा स॑ LH1 रिंग म॑ एक स्पष्ट अंतराल बन॑ छै (चित्र 1, ए आरू ई) । दू αβ हेटरोडाइमर के कमी के कारण, जेकरा म॑ चारि BChl आरू दू कैरोटीनॉइड के नुकसान के साथ, कैरोटीनॉयड म॑ स॑ कोय भी मुड़लऽ αβ-1 सबयूनिट स॑ नै जुड़ै छै, जेकरऽ परिणामस्वरूप एक LH114-W रिंग बन॑ छै जेकरा म॑ 13 कैरोटीनॉयड शाकाहारी आरू 28 BChls होय छै । αβ1 स॑ 7 क्षेत्रऽ म॑ दू परिसरऽ के स्थानीय रिजोल्यूशन अनुमान बाकी LH1 लूप के तुलना म॑ कम छै, जे आरसी क्यूबी साइट स॑ सटलऽ LH1 सबयूनिट केरऽ अंतर्निहित प्लास्टिसिटी क॑ प्रतिबिंबित करी सकै छै (चित्र 4) ।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (ए आरू बी) आरू आरसी-एलएच116 (सी आरू डी) के चित्र एक ही ऊपरी दृश्य/साइड व्यू (ए आरू बी) (ए आरू सी) (ए आरू सी) आरू चित्र 1. (बी आरू डी) के गुहा सतह स॑ दिखालऽ गेलऽ छै । रंगीन कुंजी दाहिना दिस देखाओल गेल अछि।
1:14 के स्टोइकियोमेट्रिक अनुपात वाला एकमात्र अन्य विशेषता वाला कोर परिसर रोडोकोकस स्फेरोइड्स (Rba.) आरसी-एलएच1-पफएक्स डाइमर (13) छै । लेकिन प्रोटीन डब्ल्यू आरू पफएक्स केरऽ कोनो स्पष्ट समरूपता नै छै, आरू एकरऽ अपनऽ-अपनऽ एलएच१ संरचना प॑ एकरऽ महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ै छै । PufX एक एकल TMH छै जेकरऽ N-टर्मिनल साइटोप्लाज्मिक डोमेन छै जे आरपी-एच सबयूनिट (13) केरऽ साइटोप्लाज्मिक साइड के साथ आरपीएस के अनुरूप स्थिति प॑ बातचीत करै छै । palustris LH116αβ-16। PufX आरसी-एलएच1 आरू साइटोक्रोम बीसीएल परिसर के बीच क्विनोन/क्विनोलोन आदान-प्रदान लेली एगो चैनल बनाबै छै आरू सब आरबीए म॑ मौजूद छै । स्फेरोइड्स कोर परिसर (13)। यद्यपि मोनोमर-मोनोमर अंतरफलक Rba मे अछि । स्फेरोइड्स आरसी-एलएच1-पफएक्स डाइमर आरसी-एलएच114-डब्ल्यू म॑ प्रोटीन डब्ल्यू केरऽ बाइंडिंग पोजीशन प॑ स्थित होय छै, आरू पफएक्स आरू प्रोटीन-डब्ल्यू द्वारा प्रेरित अंतराल समतुल्य स्थिति प॑ होय छै (चित्र S7A) । आरसी-एलएच114-डब्ल्यू म॑ अंतराल स्यूडोमोनास रोसिया एलएच१ केरऽ काल्पनिक क्विनोन चैनल (8) स॑ भी संरेखित छै, जे प्रोटीन डब्ल्यू या पफएक्स स॑ संबंधित नै पेप्टाइड द्वारा बनलऽ छै (चित्र S7B) । एकर अतिरिक्त बीएलसी मे क्विनोन चैनल। एक γ सबयूनिट (7) क॑ छोड़ी क॑ बनलऽ पन्ना हरे रंग के LH1 भी ऐन्हऽ ही स्थिति म॑ स्थित छै (चित्र S7C) । यद्यपि विभिन्न प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता करलऽ जाय छै, लेकिन आरसी-एलएच1 परिसर म॑ एक आम स्थिति म॑ ई क्विनोन/क्विनोलोल चैनलऽ के उपस्थिति अभिसरण विकास केरऽ उदाहरण प्रतीत होय छै, जे ई दर्शाबै छै कि प्रोटीन डब्ल्यू द्वारा पैदा करलऽ गेलऽ अंतराल क्विनोन चैनल के रूप म॑ काम करी सकै छै ।
LH114-W लूप म॑ अंतराल प्रोटीनऽ के तरह प्रोटीन छिद्र के माध्यम स॑ दूनू डोमेन क॑ जोड़ै के बजाय, आरसी-LH114-W परिसर केरऽ आंतरिक स्थान आरू थोक झिल्ली (चित्र 1G) के बीच एक निरंतर झिल्ली क्षेत्र के निर्माण के अनुमति दै छै । आरसी-एलएच116 परिसर एक बंद Tch के समान छै. सुई जैसा परिसर (22) (चित्र 1 एच)। चूँकि झिल्ली के माध्यम स॑ क्विनोन के प्रसार संकीर्ण प्रोटीन चैनल के माध्यम स॑ प्रसार स॑ तेज होय छै, ई लेली खुला LH114-W लूप बंद LH116 लूप के तुलना म॑ तेजी स॑ आरसी टर्नओवर के अनुमति द॑ सकै छै, आरू आरसी म॑ क्विनोन के प्रसार अधिक प्रतिबंधित होय सकै छै । ई परीक्षण करै लेली कि प्रोटीन डब्ल्यू आरसी के माध्यम स॑ क्विनोन के रूपांतरण क॑ प्रभावित करै छै कि नै, हमन॑ यूबिक्विनोन 2 (UQ2) (एक छोटऽ आइसोप्रीन पूंछ वाला प्राकृतिक UQ10 केरऽ एनालॉग) केरऽ एक निश्चित सांद्रता प॑ साइटोक्रोम ऑक्सीकरण परख करलकै (चित्र 2E) । यद्यपि किलेटेड क्विनोन केरऽ उपस्थिति स्पष्ट माइकेलिस स्थिरांक (RC-LH114-W आरू RC-LH116 क्रमशः 0.2±0.1μM आरू 0.5±0.2μM के लेलऽ उपयुक्त छै) केरऽ सटीक निर्धारण म॑ बाधा पहुँचै छै, लेकिन आरसी-LH114-W ( 4.6±0.2 e-RC-1 s-1) केरऽ अधिकतम दर छै आरसी-एलएच116 (3.6±0.1 ई-आरसी-1 एस-1) स॑ 28±5% बड़ऽ छै ।
हमनें शुरू म॑ अनुमान लगैलकै कि प्रोटीन-डब्ल्यू कोर परिसर (16) केरऽ लगभग 10% म॑ मौजूद छै; यहाँ, कम प्रकाश, मध्यम प्रकाश, आरू उच्च प्रकाश वृद्धि कोशिका केरऽ कब्जा दर क्रमशः 15±0.6%, 11±1% आरू 0.9±0.5 छै (चित्र 2F) । मास स्पेक्ट्रोमेट्री केरऽ मात्रात्मक तुलना स॑ पता चललै कि हिस्टिडीन टैग केरऽ जोड़ला स॑ जंगली प्रकार के उपभेद (पी = 0.59) के तुलना म॑ प्रोटीन-डब्ल्यू केरऽ सापेक्षिक प्रचुरता म॑ कमी ​​नै आबै छै, ई लेली ई स्तर संशोधित प्रोटीन-डब्ल्यू केरऽ आर्टिफैक्ट नै छै (चित्र S10) । लेकिन आरसी-एलएच1 परिसर म॑ प्रोटीन-डब्ल्यू केरऽ ई कम कब्जा कुछ आरसी क॑ त्वरित दर स॑ फ्लिप करै के अनुमति द॑ सकै छै, जेकरा स॑ आरसी-एलएच११६ परिसर म॑ धीमा क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंज क॑ कम करलऽ जाय सकै छै । हमनें देखलकै कि उच्च प्रकाश कब्जा दर हाल के ट्रांसक्रिप्टोमिक्स डेटा के साथ असंगत छै, जे संकेत करै छै कि मजबूत प्रकाश के तहत pufW जीन अभिव्यक्ति बढ़ी जाय छै (चित्र S11) (23) । आरसी-एलएच1 परिसर म॑ pufW ट्रांसक्रिप्शन आरू प्रोटीन-डब्ल्यू केरऽ समावेश के बीच के अंतर भ्रमित करै वाला छै आरू प्रोटीन केरऽ जटिल नियमन क॑ दर्शाबै सकै छै ।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू म॑ 6 कार्डियोलिपिन (सीडीएल), 7 फॉस्फेटिडाइलकोलाइन (पीओपीसी), 1 फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल (पीओपीजी) आरू 29 β-डीडीएम अणु क॑ आवंटित करी क॑ ओकरा म॑ 6 सीडीएल, 24 पीओपीसी, 2 पीओपीजी आरू 12 βडीडीएम के मॉडलिंग करलऽ जाय छै । आर सी-एलएच116 (चित्र 5, क एवं बी)। ई दूनू संरचना म॑ सीडीएल लगभग परिसर केरऽ साइटोप्लाज्मिक साइड प॑ स्थित होय छै, जबकि पीओपीसी, पीओपीजी आरू β-डीडीएम अधिकतर लुमिनल साइड प॑ स्थित होय छै । दू लिपिड आरू डिटर्जेंट अणु क॑ आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर (चित्र 5 ए) केरऽ αβ-1 स॑ αβ-6 क्षेत्र म॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै, आरू पांच आरसी-एलएच116 केरऽ समकक्ष क्षेत्र म॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै (चित्र 5 बी) । परिसर केरऽ दोसरऽ तरफ, मुख्य रूप स॑ सीडीएल प॑ अधिक लिपिड मिललै, जे आरसी आरू αβ-7 स॑ αβ-13 (चित्र 5, ए आरू बी) के बीच जमा होय गेलऽ छेलै । अन्य संरचनात्मक रूप स॑ हल करलऽ गेलऽ लिपिड आरू डिटर्जेंट LH1 रिंग के बाहर स्थित होय छै, आरू अच्छा तरह स॑ हल करलऽ गेलऽ एसिल श्रृंखला LH1 सबयूनिट के बीच फैललऽ छै, जेकरा अस्थायी रूप स॑ आरसी-एलएच114-डब्ल्यू म॑ β-डीडीएम के रूप म॑ नामित करलऽ गेलऽ छै, आरू आरसी β-डीडीएम आरू पीओपीसी-एलएच116 केरऽ मिश्रण म॑ β-डीडीएम के रूप म॑ परिभाषित करलऽ गेलऽ छै । हमरऽ संरचना म॑ किलेटिंग लिपिड आरू डिटर्जेंट केरऽ समान स्थिति संकेत करै छै कि ई शारीरिक रूप स॑ प्रासंगिक बाइंडिंग साइट छै (चित्र S12A) । Tch म॑ समतुल्य अणु केरऽ स्थिति म॑ भी अच्छा स्थिरता होय छै । कोमल एवं त्रव। तनाव 970 आरसी-एलएच1s (चित्र S12, बी स॑ ई) (9, 12) आरू लिपिड हेड समूह केरऽ हाइड्रोजन-बंधन अवशेष न॑ अनुक्रम संरेखण (चित्र S13) म॑ काफी अच्छा संरक्षण देखैलकै, जे ई दर्शाबै छै कि संरक्षित सीडीएल जे आरसी (24) स॑ जुड़ै छै, ई साइट आरसी-एलएच1 परिसर म॑ संरक्षित होय सकै छै ।
(A आरू B) RC-LH114-W (A) आरू RC-LH116 (B) पेप्टाइड क॑ कार्टून द्वारा दर्शायलऽ गेलऽ छै, आरू पिगमेंट क॑ रॉड द्वारा दर्शायलऽ गेलऽ छै, जेकरा म॑ चित्र 1 म॑ रंग योजना के उपयोग करलऽ गेलऽ छै ।लिपिड क॑ लाल रंग स॑ दिखालऽ गेलऽ छै, आरू डिटर्जेंट क॑ ग्रे म॑ दिखालऽ गेलऽ छै । आरसी क्यूए आ क्यूबी साइट सं बान्हल यूक्यू पीला रंगक अछि, जखन कि अलग-थलग यूक्यू नील रंगक अछि. (C and D) (A) आ (B) के समान विचार, लिपिड छोड़ल गेल अछि | (ई स॑ जी) आरसी-एलएच116 स॑ क्यू1(ई), क्यू2(एफ) आरू क्यू3(जी) केरऽ बढ़लऽ दृश्य, जेकरा म॑ साइड चेन छै जे एक-दूसरा क॑ प्रभावित करै छै । हाइड्रोजन बंधन क॑ कारी डैश रेखा के रूप म॑ दिखालऽ गेलऽ छै ।
आरसी-एलएच116 म॑ आरसी क्यूए आरू क्यूबी यूक्यू दूनू, जे आवेश पृथक्करण प्रक्रिया म॑ इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण म॑ भाग लै छै, अपनऽ बाइंडिंग साइट म॑ विघटित होय जाय छै । लेकिन आरसी-एलएच114-डब्ल्यू म॑ क्यूबी क्विनोन केरऽ हल नै होय सकलऽ छै आरू एकरऽ विस्तार स॑ चर्चा नीचें करलऽ जैतै । क्यूए आरू क्यूबी क्विनोन के अलावा, दू किलेटेड यूक्यू अणु (आरसी आरू एलएच1 रिंग के बीच स्थित) क॑ आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना म॑ ओकरऽ अच्छा रिजोल्यूशन हेड ग्रुप (क्रमशः क्यू1 आरू क्यू2 म॑ स्थित) के अनुसार आवंटित करलऽ जाय छै । जगह)। चित्र 5 ग)। दू आइसोप्रीन इकाई क॑ क्यू1 म॑ सौंपलऽ गेलऽ छै, आरू घनत्व मानचित्र क्यू2 केरऽ पूरा 10 आइसोप्रीन पूंछ क॑ हल करै छै । आरसी-एलएच116 केरऽ संरचना म॑ तीन किलेटेड यूक्यू10 अणु (क्यू1 स॑ क्यू3, चित्र 5डी) हल होय गेलऽ छेलै, आरू सब अणु केरऽ पूरा पूंछ म॑ स्पष्ट घनत्व होय छै (चित्र 5, डी स॑ जी) । दूनू संरचना म॑ क्यू1 आरू क्यू2 केरऽ क्विनोन हेड समूह केरऽ स्थिति म॑ उत्कृष्ट स्थिरता छै (चित्र S12F), आरू ई केवल आरसी के साथ बातचीत करै छै । क्यू1 आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (चित्र 1जी आरू 5, सी, डी आरू ई) केरऽ डब्ल्यू गैप केरऽ प्रवेश द्वार प॑ स्थित छै, आरू क्यू2 क्यूबी बाइंडिंग साइट (चित्र 5, सी, डी) आरू एफ) के पास स्थित छै । संरक्षित L-Trp143 आरू L-Trp269 अवशेष Q1 आरू Q2 के बहुत करीब छै आरू संभावित π-स्टैकिंग बातचीत (चित्र 5, ई आरू एफ, आरू चित्र S12) प्रदान करै छै. L-Gln88, Q1 केरऽ डिस्टल ऑक्सीजन स॑ 3.0 Å, एक मजबूत हाइड्रोजन बंधन (चित्र 5E) प्रदान करै छै; इ अवशेष सबस दूर संबंध कें छोड़िक कें सब आरसी मे संरक्षित छै (चित्र S13) । L-Ser91 अधिकांश अन्य आरसी (चित्र S13) म॑ Thr केरऽ रूढ़िवादी रूप स॑ प्रतिस्थापित छै, Q1 केरऽ मिथाइल ऑक्सीजन स॑ 3.8 एंगस्ट्रॉम छै, आरू कमजोर हाइड्रोजन बंधन प्रदान करी सकै छै (चित्र 5E) । Q3 केरऽ कोनों विशिष्ट अंतःक्रिया नै प्रतीत होय छै, लेकिन आरसी-एम सबयूनिट आरू LH1-α सबयूनिट 5 स॑ 6 के बीच हाइड्रोफोबिक क्षेत्र म॑ स्थित होय छै (चित्र 5, डी आरू जी) । Q1, Q2 आरू Q3 या पास केरऽ किलेटेड क्विनोन भी Tch म॑ हल होय गेलऽ छै । कोमल, त्रव। तनाव 970 एवं बीएलसी। परितारिका संरचना (9, 10, 12) आरसी-एलएच1 परिसर (चित्र S12G) म॑ एक संरक्षित सहायक क्विनोन बाइंडिंग साइट के तरफ इशारा करै छै । आरसी-एलएच116 म॑ पांच विघटित यूक्यू उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा निर्धारित हर परिसर केरऽ 5.8±0.7 स॑ अच्छा सहमति म॑ छै, जबकि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू म॑ तीन विघटित यूक्यू स॑ कम छै 6.2±0.3 केरऽ मापलऽ गेलऽ मान (चित्र S14) स॑ पता चलै छै कि संरचना म॑ अनसुलझे यूक्यू अणु छै ।
छद्म-सममित एल आरू एम पॉलीपेप्टाइड म॑ हर एक म॑ पाँच टीएमएच होय छै आरू एक हेटरोडाइमर बनाबै छै जे एक बीसीएचएल डाइमर, दू बीसीएचएल मोनोमर, दू बैक्टीरियोफेज (बीपीएच) मोनोमर, आरू एक गैर- हीम आयरन आरू एक या दू यूक्यू१० अणु के संयोजन करै छै । टर्मिनल कीटोन समूह प॑ हाइड्रोजन बंधन केरऽ उपस्थिति आरू आरपीएस म॑ एकरऽ ज्ञात संचय के माध्यम स॑ कैरोटीनॉयड क॑ एम-सबयूनिट म॑ शामिल करलऽ जाय छै, जेकरा सिस-३,४-डीहाइड्रोर्होडोपिन नाम देलऽ जाय छै । प्रजाति (25)। आरसी-एच केरऽ बाहरी झिल्ली डोमेन एकल टीएमएच द्वारा झिल्ली स॑ लंगर डाललऽ जाय छै । समग्र आरसी संरचना संबंधित प्रजाति (जैना आरबीए) के तीन उप-इकाई आरसी के समान छै. स्फेरोइड्स (पीडीबी आईडी: 3I4D)। बीसीएचएल आरू बीपीएच केरऽ मैक्रोसाइकिल, कैरोटीनॉयड रीढ़ आरू गैर-हीम आयरन ई संरचना केरऽ रिजोल्यूशन रेंज के भीतर ओवरलैप होय जाय छै, जेना कि क्यूए साइट प॑ यूक्यू10 हेड ग्रुप आरू आरसी-एलएच116 प॑ क्यूबी क्विनोन (चित्र S15) ।
अलग-अलग क्यूबी साइट कब्जा दर वाला दू आरसी संरचना के उपलब्धता क्यूबी क्विनोन बाइंडिंग के साथ लगातार संरचनात्मक परिवर्तन के जांच करै के एगो नया अवसर प्रदान करै छै. आरसी-एलएच116 परिसर म॑ क्यूबी क्विनोन पूर्ण रूप स॑ बाउंड “प्रोक्सिमल” स्थिति (26) म॑ स्थित छै, लेकिन आरसी-एलएच114-डब्ल्यू केरऽ पृथक्करण म॑ क्यूबी क्विनोन नै होय छै । आरसी-एलएच114-डब्ल्यू म॑ क्यूबी क्विनोन नै छै, जे आश्चर्यजनक छै, कैन्हेंकि ई परिसर सक्रिय छै, संरचनात्मक रूप स॑ रिजोल्यूशन क्यूबी क्विनोन वाला आरसी-एलएच116 परिसर स॑ अधिक । यद्यपि दूनू LH1 रिंग लगभग छह क्विनोन के किलेट करैत अछि, बंद आरसी-LH116 रिंग में पांच संरचनात्मक रूप सं रिजोल्यूशन होइत अछि, जखन कि खुला RC-LH114-W रिंग में मात्र तीन संरचनात्मक रूप सं सीमित अछि . ई बढ़लऽ संरचनात्मक विकार आरसी-एलएच114-डब्ल्यू क्यूबी साइट केरऽ तेजी स॑ प्रतिस्थापन, परिसर म॑ तेजी स॑ क्विनोन गतिकी, आरू एलएच१ लूप पार करै के बढ़लऽ संभावना क॑ दर्शाबै सकै छै । हम सुझाव दै छियै कि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू केरऽ आरसी क्यूबी साइट म॑ यूक्यू के कमी एगो अधिक जटिल आरू अधिक सक्रिय परिसर के परिणाम हो सकै छै, आरू आरसी-एलएच114-डब्ल्यू केरऽ क्यूबी साइट यूक्यू टर्नओवर म॑ तुरंत जमलऽ छै विशिष्ट चरण (क्यूबी साइट केरऽ प्रवेश द्वार बंद करी देलऽ गेलऽ छै) ई गतिविधि केरऽ संरचना क॑ दर्शाबै छै ।
क्यूबी के बिना, एल-फे217 केरऽ साथ घूमना ऐन्हऽ स्थिति म॑ जे यूक्यू10 बाइंडिंग के साथ असंगत छै, कैन्हेंकि ई पूंछ केरऽ पहिलऽ आइसोप्रीन इकाई स॑ स्थानिक टक्कर पैदा करतै (चित्र 6A) । एकरऽ अलावा, स्पष्ट मुख्य संरचनात्मक परिवर्तन स्पष्ट छै, खास करी क॑ हेलिक्स डी (टीएमएच डी आरू ई के बीच लूप म॑ छोटऽ हेलिक्स) जहाँ L-Phe217 क॑ क्यूबी बाइंडिंग पॉकेट म॑ शिफ्ट करलऽ जाय छै आरू L-Tyr223 केरऽ घुमाव (चित्र 6A ) M-Asp45 ढाँचा के साथ हाइड्रोजन बंधन क॑ तोड़ै लेली आरू QB बाइंडिंग साइट केरऽ प्रवेश द्वार बंद करै लेली (चित्र 6 ख)। हेलिक्स अपनऽ आधार प॑ डी पिवट होय जाय छै, L-Ser209 केरऽ Cα 0.33Å शिफ्ट होय जाय छै, जबकि L-Val221Cα 3.52Å शिफ्ट होय जाय छै । टीएमएच डी आरू ई म॑ कोनों अवलोकनीय परिवर्तन नै छै, जे दूनू संरचना म॑ सुपरइम्पोजेबल छै (चित्र 6 ए) । जहाँ तक हमरा सब क॑ पता छै कि प्राकृतिक आरसी म॑ ई पहिलऽ संरचना छै जे क्यूबी साइट क॑ बंद करी दै छै । पूर्ण (क्यूबी-बाउंड) संरचना के साथ तुलना करला स॑ पता चलै छै कि क्विनोन क॑ कम होय स॑ पहल॑ ओकरा क्विनोन म॑ प्रवेश करै लेली संरचनात्मक परिवर्तन के जरूरत होय छै । L-Phe217 घूमी क॑ क्विनोन हेड समूह के साथ π-स्टैकिंग इंटरैक्शन बनाबै छै, आरू हेलिक्स बाहर तरफ शिफ्ट होय जाय छै, जेकरा स॑ L-Gly222 केरऽ कंकाल आरू L-Tyr223 केरऽ साइड चेन क॑ स्थिर हाइड्रोजन बॉन्ड संरचना के साथ हाइड्रोजन बॉन्ड नेटवर्क बनाबै के अनुमति मिलै छै (चित्र 6, ए आरू सी) ।
(A) होलोग्राम (एल चेन, ऑरेंज/एम चेन, मैजेंटा) आरू एपो (ग्रे) संरचना केरऽ ओवरलैपिंग कार्टून, जेकरा म॑ प्रमुख अवशेष क॑ रॉड जैसनऽ प्रतिनिधित्व के रूप म॑ प्रदर्शित करलऽ जाय छै । UQ10 क॑ पीला रंग केरऽ बार द्वारा दर्शायलऽ जाय छै । बिंदीदार रेखा पूरा संरचना म॑ बनलऽ हाइड्रोजन बंधन क॑ दर्शाबै छै । (B आरू C) एपोलिपोप्रोटीन आरू पूरा रिंग संरचना केरऽ सतह प्रतिनिधित्व, क्रमशः नीले रंग म॑ L-Phe217 आरू लाल रंग म॑ L-Tyr223 केरऽ साइड चेन ऑक्सीजन क॑ उजागर करै छै । एल उप-इकाई नारंगी रंगक होइत अछि; एम आ एच सबयूनिट रंगीन नहि होइत अछि । (डी आरू ई) एपोलिपोप्रोटीन (डी) आरू पूरा (ई) आरसी क्यूबी साइट [क्रमशः (ए) द्वारा रंग] आरू थर्मोफिलस थर्मोफिलस पीएसआईआई (प्लास्टिक क्विनोन के साथ हरे, नीला; पीडीबी आईडी: 3WU2) संरेखित (58) ।
अप्रत्याशित रूप स॑, हालांकि एलएच१ के बिना क्यूबी-कमी वाला आरसी केरऽ कई संरचना उपलब्ध छै, लेकिन ई अध्ययन म॑ देखलऽ गेलऽ संरचनात्मक परिवर्तन केरऽ रिपोर्ट पहल॑ नै करलऽ गेलऽ छै । एहि मे बीएलसी स क्यूबी डिप्लीशन स्ट्रक्चर शामिल अछि। viridis (पीडीबी आईडी: 3PRC) (27), Tch। टेपिडम (पीडीबी आईडी: 1EYS) (28) आ आरबीए। sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), जे सब लगभग अपनऽ समग्र क्यूबी संरचना के समान छै । 3PRC केरऽ करीबी निरीक्षण स॑ पता चललै कि एलडीएओ (लॉरिल डाइमिथाइल अमाइन ऑक्साइड) डिटर्जेंट अणु क्यूबी स्थिति केरऽ प्रवेश द्वार प॑ जुड़ै छै, जेकरा स॑ बंद संरचना म॑ पुनर्व्यवस्था नै होय सकै छै । यद्यपि एलडीएओ 1EYS या 1OGV मे एकहि स्थिति मे विघटित नहि होयत छै, मुदा इ आरसी एकहि डिटर्जेंट कें उपयोग सं तैयार कैल जायत छै आ अइ कें लेल एकहि प्रभाव पैदा कयर सकय छै. आरबीए की स्फटिक संरचना। साइटोक्रोम c2 (PDB ID: 1L9B) के साथ सह-स्फटिकीकृत स्फेरोइड्स आरसी केरऽ भी बंद क्यूबी साइट लगै छै । लेकिन, ऐन्हऽ मामला म॑ आरसी-एम पॉलीपेप्टाइड केरऽ एन-टर्मिनल क्षेत्र (क्यू हेलिक्स प॑ Tyr अवशेष केरऽ एच बंधन के माध्यम स॑ क्यूबी बाइंडिंग साइट के साथ बातचीत करै वाला) एक अप्राकृतिक संरचना अपनाबै छै, आरू क्यूबी संरचनात्मक परिवर्तन केरऽ आगू खोज नै करलऽ जाय छै ( 30 ). जे बात आश्वस्त करय वाला छै, वू ई छै कि हम्में आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना म॑ एम पॉलीपेप्टाइड केरऽ ई तरह के विरूपण नै देखन॑ छियै, जे लगभग आरसी-एलएच116 आरसी केरऽ एन-टर्मिनल क्षेत्र के समान छै । ई भी ध्यान देना चाहियऽ कि डिटर्जेंट आधारित एलएच१ एंटीना केरऽ उन्मूलन के बाद पीडीबी म॑ एपोलिपोप्रोटीन आरसी केरऽ समाधान होय ​​गेलै, जेकरा स॑ आरसी आरू आसपास केरऽ एलएच१ रिंग केरऽ भीतरी सतह के बीच के अंतराल म॑ आंतरिक क्विनोन पूल आरू लिपिड क॑ समाप्त करी देलऽ गेलै (31, 32) । आरसी कार्यात्मक रहै छै, कैन्हेंकि ई सब कोफैक्टर क॑ बरकरार रखै छै, सिवाय विघटन योग्य क्यूबी क्विनोन के, जे कम स्थिर होय छै आरू अक्सर तैयारी प्रक्रिया के दौरान खो जाय छै (33) । एकरऽ अलावा, ई जानलऽ जाय छै कि आरसी स॑ एलएच१ आरू प्राकृतिक चक्रीय लिपिड क॑ हटाबै स॑ कार्यऽ प॑ प्रभाव पड़॑ सकै छै, जेना कि चार्ज-अलग पी+क्यूबी-स्टेट केरऽ कम जीवनकाल (31, 34, 35) । अतः, हम अनुमान लगाबै छियै कि आरसी के आसपास स्थानीय एलएच1 रिंग के अस्तित्व स॑ “बंद” क्यूबी साइट क॑ बरकरार रखलऽ जाब॑ सकै छै, जेकरा स॑ क्यूबी के पास स्थानीय वातावरण सुरक्षित होय सकै छै ।
यद्यपि एपोलिपोप्रोटीन (क्यूबी क्विनोन के बिना) आरू पूरा संरचना क्यूबी साइट केरऽ टर्नओवर केरऽ केवल दू स्नैपशॉट के प्रतिनिधित्व करै छै, नै कि घटना केरऽ एक श्रृंखला के बजाय, लेकिन ऐन्हऽ संकेत छै कि हाइड्रोक्विनोन द्वारा पुनः बाइंडिंग क॑ रोकै लेली बाइंडिंग क॑ गेट करलऽ जाब॑ सकै छै सब्सट्रेट निषेध क॑ रोकै लेली । एपोलिपोप्रोटीन केरऽ क्यूबी साइट के पास क्विनोलोल आरू क्विनोन केरऽ परस्पर क्रिया अलग-अलग होय सकै छै, जेकरा चलतें आरसी द्वारा एकरा अस्वीकार करलऽ जाय छै । बहुत दिन स॑ ई प्रस्तावित करलऽ जाय रहलऽ छै कि संरचनात्मक परिवर्तन क्विनोन केरऽ बाइंडिंग आरू रिडक्शन म॑ भूमिका निभाबै छै । जमे हुए आरसी केरऽ क्षमता अंधेरे अनुकूलन के बाद क्विनोन क॑ कम करै के क्षमता बिगड़ जाय छै ( 36 ); एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी स॑ पता चलै छै कि ई क्षति क्यूबी क्विनोन क॑ सक्रिय समीपस्थ स्थिति स॑ लगभग 4.5 Å “डिस्टल” संरचना म॑ फंसला के कारण होय छै (26) , 37) । हम सुझाव दै छियै कि ई डिस्टल बाइंडिंग संरचना एपोलिपोप्रोटीन आरू पूर्ण रिंग संरचना के बीच के मध्यवर्ती अवस्था के स्नैपशॉट छै, जे क्विनोन के साथ प्रारंभिक बातचीत आरू क्यूबी साइट के खुलला के बाद होय छै.
कुछ फोटोट्रोफिक बैक्टीरिया आरू सियानोबैक्टीरिया, शैवाल आरू पौधा के पीएसआईआई परिसर म॑ मिलै वाला प्रकार II आरसी के संरचनात्मक आरू कार्यात्मक संरक्षण छै ( 38 ). चित्र 6 (डी आरू ई) म॑ दिखालऽ गेलऽ संरचनात्मक संरेखण पीएसआईआई आरसी आरू बैक्टीरियल आरसी परिसर केरऽ क्यूबी साइट के बीच समानता प॑ जोर दै छै । ई तुलना बहुत दिन स॑ क्विनोन बाइंडिंग आरू रिडक्शन केरऽ निकट संबंधित प्रणाली के अध्ययन लेली एगो मॉडल रहलऽ छै । पिछला प्रकाशनऽ स॑ पता चललै कि संरचनात्मक परिवर्तन के साथ-साथ क्विनोन केरऽ पीएसआईआई कमी भी होय छै ( 39 , 40 ). अतः आरसी केरऽ विकासवादी संरक्षण प॑ विचार करतें हुअ॑ ई पहिने स॑ अनदेखलऽ बाइंडिंग तंत्र ऑक्सीजनयुक्त फोटोट्रोफिक पौधा म॑ पीएसआईआई आरसी केरऽ क्यूबी साइट प॑ भी लागू होय सकै छै ।
Rps ΔpufW (अलेबल pufW डिलीशन) आरू PufW-His (C-टर्मिनल 10x His-टैग प्रोटीन-W प्राकृतिक pufW लोकस स॑ व्यक्त) उपभेद । palustris CGA009 केरऽ वर्णन हमरऽ पिछला काम ( 16 ) म॑ करलऽ गेलऽ छेलै । ई उपभेद आरू आइसोजेनिक जंगली-प्रकार के माता-पिता क॑ फ्रीजर स॑ पीवाईई (प्रत्येक 5 ग्राम लीटर -1) (-80 डिग्री सेल्सियस प॑ एलबी म॑ संग्रहित, जेकरा म॑ 50% ( w/v) ग्लिसरॉल) प्रोटीन, खमीर अर्क आरू सुसिनेट) अगर [1.5% (w/v)] प्लेट प॑ कम संख्या म॑ कोशिका क॑ स्ट्रीकिंग करी क॑ बरामद करलऽ गेलऽ छेलै । प्लेट क॑ अवायवीय परिस्थिति म॑ कमरा केरऽ तापमान प॑ रात भर अन्हार म॑ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद ओएसआरएएम 116-डब्ल्यू हैलोजन बल्ब (आरएस कंपोनेंट, यूके) द्वारा उपलब्ध कराय देलऽ गेलऽ सफेद रोशनी (~50 μmolm-2 s-1) स॑ 3 स॑ 5 दिन तलक रोशन करलऽ गेलऽ छेलै जब॑ तलक कि एकल कॉलोनी नै दिखाय देलऽ गेलऽ छेलै । एकल कॉलोनी कें उपयोग 0.1% (w/v) कैसामिनो एसिड (अइ सं M22 कहल जैतय) कें पूरक 10 मिलीलीटर M22+ माध्यम (41) कें टीकाकरण कें लेल करल गेलय छेलै. कल्चर क॑ कम ऑक्सीजन केरऽ परिस्थिति म॑ 34 डिग्री सेल्सियस प॑ अन्हार म॑ 180 आरपीएम प॑ 48 घंटा तलक हिलाबै के साथ उगालऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद 70 मिलीलीटर कल्चर क॑ वू ही परिस्थिति म॑ 24 घंटा तलक टीका लगाय देलऽ गेलऽ छेलै । 1 मिलीलीटर कें आयतन वाला अर्ध-एरोबिक संस्कृति कें उपयोग 30 मिलीलीटर यूनिवर्सल स्क्रू-टॉप पारदर्शी कांच कें बोतल मे 30 मिलीलीटर एम22 माध्यम कें टीकाकरण कें लेल कैल जायत छै आ बाँझ चुंबकीय बल हलचल छड़ सं 48 घंटा तइक हलचल (~50μmolm-2 s-1) सं विकिरणित कैल जायत छै. तखन 30 मिलीलीटर संवर्धन कें लगभग 1 लीटर संवर्धन सं ओही परिस्थितिक मे टीकाकरण कैल गेलय, जेकर उपयोग तखन ~200 μmolm-2 s-1 पर 72 घंटा तइक रोशन कैल गेल लगभग 9 लीटर संवर्धन कें टीकाकरण कें लेल कैल गेलय. कोशिका क॑ 7132 आरसीएफ प॑ 30 मिनट तलक अपकेंद्रित्रण द्वारा कटाई करलऽ गेलऽ छेलै, ~10 मिलीलीटर 20 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) म॑ पुनः निलंबित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू जरूरत तलक -20 डिग्री सेल्सियस प॑ संग्रहीत करलऽ गेलऽ छेलै ।
पिघलला के बाद पुनः निलंबित कोशिका मे डिऑक्सीराइबोन्यूक्लियस I (मर्क, यूके), लाइसोजाइम (मर्क, यूके) आ दू टा रोश होलोएंजाइम प्रोटीज अवरोधक गोली (मर्क, यूके) के किछु क्रिस्टल मिला दियौ । 20,000 पीएसआई फ्रेंच प्रेशर सेल (अमिन्को, अमेरिका) म॑ कोशिका क॑ 8 स॑ 12 बार बाधित करलऽ गेलऽ छेलै । अटूट कोशिका आरू अघुलनशील मलबा क॑ 4°C प॑ 15 मिनट तलक 18,500 RCF प॑ अपकेंद्रित्रण द्वारा हटाबै के बाद, झिल्ली क॑ 113,000 RCF प॑ 43,000°C प॑ 2 घंटा तलक अपकेंद्रित्रण द्वारा पिगमेंटेड लाइसेट स॑ अवक्षेपित करलऽ गेलऽ छेलै । घुलनशील अंश कें फेंक दिअ आ रंगीन झिल्ली कें 100 सं 200 मिलीलीटर 20 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) मे फेर सं लटका दिअ आ एकरूप बनाउ जा धरि कोनों दृश्यमान समुच्चय नहि भ जायत. निलंबित झिल्ली क॑ 2% (w/v) β-DDM युक्त 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) म॑ 4°C प॑ अंधेरे म॑ 1 घंटा तलक हल्का हलचल के साथ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । तखन 70 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्रित कए 150,000 आरसीएफ कए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटा धरि घोल कए अवशिष्ट अघुलनशील पदार्थ कए हटाउ ।
ΔpufW तनाव स॑ घुलनशील झिल्ली क॑ 50 मिलीलीटर DEAE Sepharose आयन विनिमय कॉलम प॑ बाइंडिंग बफर [20 mM tris-HCl (pH 8.0) जेकरा म॑ 0.03% (w / v) β-DDM] केरऽ तीन कॉलम वॉल्यूम (CV) छेलै, लागू करलऽ गेलऽ छेलै । कॉलम कें दू सीवी बाइंडिंग बफर सं धोऊं, आ ओकर बाद कॉलम कें दू बाइंडिंग बफर सं धोऊं जइ मे 50 mM NaCl होयत छै. आरसी-एलएच116 परिसर क॑ 1.75 सीवी प॑ 150 स॑ 300 एमएम NaCl (बाइंडिंग बफर म॑) के रैखिक ढाल स॑ इल्यूट करलऽ गेलऽ छेलै, आरू शेष बाइंडिंग परिसर क॑ 0.5 सीवी प॑ 300 एमएम NaCl वाला बाइंडिंग बफर स॑ इल्यूट करलऽ गेलऽ छेलै । 250 आरू 1000 एनएम के बीच अवशोषण स्पेक्ट्रम क॑ एकत्रित करी क॑ 880 स॑ 280 एनएम प॑ 1 स॑ अधिक अवशोषण अनुपात (A880/A280) वाला अंश क॑ रखलऽ जाय, ओकरा बाइंडिंग बफर म॑ दू बार पतला करी क॑ शुद्धिकरण प॑ डीईएई कॉलम प॑ फेर स॑ वू ही प्रक्रिया के प्रयोग करलऽ जाय । 1.7 सं बेसि A880/A280 अनुपात आ 3.0 सं बेसि A880/A805 अनुपात वाला अंशक कें पतला करूं, आयन विनिमय कें तेसर दौर कें प्रदर्शन करूं, आ 2.2 सं बेसि A880/A280 अनुपात आ 5.0 सं बेसि A880/A805 अनुपात वाला अंशक कें बरकरार राखूं. आंशिक रूप स॑ शुद्ध परिसर क॑ एमिकॉन 100,000 आणविक भार कट-ऑफ (MWCO) केन्द्रापसारक फिल्टर (मर्क, यूके) म॑ ~2 मिलीलीटर तलक गाढ़ा करलऽ गेलऽ छेलै, आरू सुपरडेक्स 200 16/600 आकार बहिष्कार कॉलम (जीई हेल्थकेयर, यूएस) प॑ लोड करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ 200 एमएम NaCl बफर छेलै, आरू ओकरा बाद वू ही बफर म॑ 1.5 CV प॑ इल्यूट करलऽ गेलऽ छेलै । आकार बहिष्कार अंश कें अवशोषण स्पेक्ट्रा एकत्रित करूं, आ 2.4 सं बेसि A880/A280 अनुपात आ 5.8 सं 100 A880 सं बेसि A880/A805 अनुपात कें साथ अवशोषण स्पेक्ट्रा कें केंद्रित करूं, आ तुरंत क्रायो-टीईएम ग्रिड तैयारी या भंडारण कें लेल ओकर उपयोग करूं -80°C पर जरूरत कें समय तइक राखूं.
PufW-His तनाव स॑ घुलनशील झिल्ली क॑ IMAC बफर ( जीई हेल्थकेयर) म॑ 20 मिलीलीटर HisPrep FF Ni-NTA Sepharose कॉलम (20 mM tris-HCl (pH 8.0) जेकरा म॑ 200 mM NaCl आरू 0.03% (w/w) छेलै) प॑ लगाय देलऽ गेलऽ छेलै । v) β-डीडीएम]। कॉलम क॑ पांच सीवी आईएमएसी बफर स॑ धोलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद आईएमएसी बफर केरऽ पांच सीवी स॑ धोलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ 10 एमएम हिस्टिडीन छेलै । कोर परिसर क॑ कॉलम स॑ पांच आईएमएसी बफर स॑ इल्यूट करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ 100 एमएम हिस्टिडीन छेलै । आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर युक्त अंश क॑ एमिकॉन 100,000 मेगावाट सीओ फिल्टर (मर्क, यूके) स॑ लैस हलचल वाला टैंक म॑ ~10 मिलीलीटर तलक गाढ़ा करलऽ जाय छै, बाइंडिंग बफर स॑ 20 बार पतला करलऽ जाय छै, आरू ओकरा बाद 25 मिलीलीटर तलक मिलालऽ जाय छै डीईएई सेफारोज कॉलम म॑ बफर स॑ बंधलऽ चार सीवी के उपयोग पहिने स॑ करलऽ जाय छै । कॉलम कें चारि सीवी बाइंडिंग बफर सं धोउ, तखन 0 सं 100 एमएम NaCl (बाइंडिंग बफर मे) कें रैखिक ढाल पर आठ सीवी पर परिसर कें इल्यूट करूं, आ 100 एमएम बाइंडिंग बफर युक्त शेष चारि सीवी कें सोडियम क्लोराइड पर इल्यूट कैल गेल अवशिष्ट परिसर 2.4 सं बेसि A880/A280 अनुपात कें साथ मिल क 4.6 अंश स॑ अधिक A880/A805 अनुपात क॑ एमिकॉन 100,000 मेगावाट केन्द्रापसारक फिल्टर म॑ ~2 मिलीलीटर तलक गाढ़ा करलऽ गेलऽ छेलै, आरू अग्रिम म॑ 1.5 सीवी आईएमएसी स॑ भरलऽ गेलऽ छेलै बफर संतुलित सुपरडेक्स 200 16/600 आकार बहिष्कार स्तंभ म॑, आरू ओकरा बाद 1.5 सीवी प॑ वही बफर म॑ इल्यूट करलऽ गेलऽ छेलै । आकार-बहिष्कार अंशक कें अवशोषण स्पेक्ट्रा कें संग्रहण करूं आ अवशोषण स्पेक्ट्रा कें 2.1 सं बेसि A880/A280 अनुपात आ 4.6 सं 100 A880 सं बेसि A880/A805 अनुपात कें साथ केंद्रित करूं, जे तुरंत जमे हुए टीईएम ग्रिड तैयार करय कें लेल उपयोग करल जाय छै या जरूरत तइक -80°C पर संग्रहीत करल जाय छै.
कम तापमान वाला टीईएम ग्रिड तैयार करय कें लेल लीका ईएम जीपी इमर्सन फ्रीजर कें उपयोग करल गेलय छेलै. परिसर क॑ आईएमएसी बफर म॑ पतला करी क॑ 50 केरऽ A880 करी देलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद 5μl क॑ एक नव ग्लो-डिस्चार्ज QUANTIFOIL 1.2/1.3 कार्बन-लेपित तांबा जाली (Agar Scientific, UK) प॑ लोड करलऽ गेलऽ छेलै । ग्रिड कें 20°C आ 60% सापेक्षिक आर्द्रता पर 30 s तइक इन्क्यूबेट करूं, फेर ओकरा 3 s तइक ब्लॉट करूं सुखाऊं, आ ओकरा बाद -176°C पर तरल ईथेन मे बुझाऊं.
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर केरऽ डाटा क॑ ईबीआईसी (इलेक्ट्रॉनिक बायोइमेजिंग सेंटर) (ब्रिटिश डायमंड लाइट सोर्स) प॑ टाइटन क्रिओस माइक्रोस्कोप स॑ रिकॉर्ड करलऽ गेलऽ छेलै, जे 300 केवी के त्वरक वोल्टेज प॑ काम करै छै, जेकरऽ नाममात्र के आवर्धन 130,000× आरू ऊर्जा के साथ- 20 ईवी के अंतराल चुनऽ । के2 पीक डिटेक्टर वाला गैटन 968 जीआईएफ क्वांटम के उपयोग काउंटिंग मोड म॑ छवि रिकॉर्ड करै लेली करलऽ गेलऽ छेलै ताकि डाटा एकत्रित करलऽ जाय सक॑ । कैलिब्रेटेड पिक्सेल आकार 1.048Å छै, आरू खुराक दर 3.83 e-Å-2s-1 छै. 11 सेकेंड में सिनेमा के संग्रह क 40 भाग में बांटल। सूक्ष्मदर्शी कें पुनः केंद्रित करय कें लेल कार्बन-लेपित क्षेत्र कें उपयोग करूं, आ ओकर बाद प्रति छेद तीन फिल्म एकत्रित करूं. कुल मिला क॑ ३१३० सिनेमा एकत्रित करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरऽ डिफोकस मान -१ आरू -३μm के बीच छेलै ।
आरसी-एलएच116 परिसर केरऽ आंकड़ा एस्टरबरी बायोस्ट्रक्चर प्रयोगशाला (यूनिवर्सिटी ऑफ लीड्स, यूके) म॑ वही सूक्ष्मदर्शी के उपयोग करी क॑ एकत्रित करलऽ गेलऽ छेलै । ई आंकड़ा क॑ गिनती मोड म॑ 130 k के आवर्धन के साथ एकत्रित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू पिक्सेल आकार क॑ 4.6 e-Å-2s-1 के खुराक के साथ 1.065 Å तलक कैलिब्रेट करलऽ गेलऽ छेलै । सिनेमा के रिकॉर्डिंग 12 सेकेंड में भेल छल आ 48 भाग में बांटल गेल छल। कुल मिला क॑ ३३५९ फिल्म एकत्रित करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरऽ डिफोकस मान -१ आरू -३μm के बीच छेलै ।
सबटा डाटा प्रोसेसिंग रिलियन 3.0 पाइपलाइन (42) मे कैल जायत छै. खुराक भार द्वारा बीम गति कें सही करय कें लेल Motioncorr 2 (43) कें उपयोग करूं, आ ओकर बाद CTF (कंट्रास्ट ट्रांसफर फंक्शन) पैरामीटर कें निर्धारित करय कें लेल CTFFIND 4.1 (44) कें उपयोग करूं. इ प्रारंभिक प्रसंस्करण चरणक कें बाद विशिष्ट फोटोमाइक्रोग्राफ चित्र 2. S16 मे दिखायल गेल छै. स्वचालित चयन टेम्पलेट 250 पिक्सेल फ्रेम म॑ 1000 कणऽ के लगभग 250 पिक्सेल के मैन्युअल रूप स॑ चयन करी क॑ आरू कोनों संदर्भ द्वि-आयामी (2D) वर्गीकरण नै करी क॑ उत्पन्न करलऽ जाय छै, जेकरा स॑ वू वर्गीकरण क॑ खारिज करी देलऽ जाय छै जे नमूना दूषित होय क॑ पूरा करै छै या जेकरा म॑ कोनों भेद्य विशेषता नै छै । तखन, सब माइक्रोफोटोग्राफ पर स्वचालित चयन कयल गेल, आ आरसी-एलएच114-डब्ल्यू 849,359 कण छल, आ आरसी-एलएच116 परिसर 476,547 कण छल । सब चयनित कणक कें गैर-संदर्भ 2D वर्गीकरण कें दू दौर सं गुजरल गेल छै, आ प्रत्येक रन कें बाद, कार्बन क्षेत्र, नमूना दूषितता, कोनों स्पष्ट विशेषता या मजबूती सं ओवरलैपिंग कणक कें पूरा करय वाला कणक कें अस्वीकार कैल जायत छै, जेकर परिणामस्वरूप 772,033 (90.9%) आ 359,678 (75.5%) ) कणक कें उपयोग 3D वर्गीकरण कें लेल कैल जायत छै क्रमशः आरसी-एलएच114-डब्ल्यू एवं आरसी-एलएच116। प्रारंभिक 3D संदर्भ मॉडल क॑ स्टोचैस्टिक ढाल वंश विधि के उपयोग करी क॑ उत्पन्न करलऽ गेलऽ छेलै । प्रारंभिक मॉडल क॑ संदर्भ के रूप म॑ प्रयोग करी क॑ चुनलऽ गेलऽ कणऽ क॑ 3D म॑ चार श्रेणी म॑ वर्गीकृत करलऽ जाय छै । ई श्रेणी म॑ मॉडल क॑ संदर्भ के रूप म॑ इस्तेमाल करी क॑, सबसें बड़ऽ श्रेणी के कणऽ प॑ 3D रिफाइनिग करलऽ जाय, तखनिये सॉल्वेंट क्षेत्र क॑ कवर करै लेली प्रारंभिक 15Å लो-पास फिल्टर के उपयोग करलऽ जाय, 6 पिक्सेल के नरम किनारे जोड़लऽ जाय, आरू पिक्सेल क॑ पोस्ट-प्रोसेस करी क॑ टॉप डिटेक्टर केरऽ गैटन के2 पीक मॉड्यूलेशन ट्रांसफर फंक्शन क॑ सही करलऽ जाय । आरसी-एलएच114-डब्ल्यू डाटासेट लेली ई प्रारंभिक मॉडल क॑ मास्क केरऽ किनारे प॑ मजबूत घनत्व (यूसीएसएफ काइमेरा म॑ कोर कॉम्प्लेक्स घनत्व स॑ विच्छेदित) क॑ हटाय क॑ संशोधित करलऽ गेलऽ छेलै । परिणामस्वरूप मॉडल (आरसी-एलएच114-डब्ल्यू आरू आरसी-एलएच116 केरऽ रिजोल्यूशन क्रमशः 3.91 आरू 4.16 ए छै) क॑ 3D वर्गीकरण केरऽ दोसरऽ दौर लेली संदर्भ के रूप म॑ प्रयोग करलऽ जाय छै । प्रयोग करलौ गेलौ कणौ क प्रारंभिक 3D वर्ग मँ समूहीकृत करलौ गेलौ छै आरू ओकरा मँ पड़ोस के साथ मजबूत सहसंबंध नै छै । स्पष्ट संरचनात्मक विशेषताक ओवरलैप वा अभाव। 3D वर्गीकरण केरऽ दोसरऽ दौर के बाद, सबसें अधिक रिजोल्यूशन वाला श्रेणी के चयन करलऽ गेलऽ छेलै [आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के लेलऽ, एक श्रेणी 377,703 कण (44.5%) छै, आरसी-एलएच116 के लेलऽ, दू श्रेणी छै, कुल 260,752 कण (54.7%) , जहाँ ई तखनी एक जैसनऽ होय छै जब॑ प्रारंभिक घुमाव के बाद छोटऽ अंतर के साथ संरेखित करलऽ जाय छै] । चयनित कण क॑ ४०० पिक्सेल केरऽ बॉक्स म॑ पुनः निकाललऽ जाय छै आरू 3D रिफाइनिंग द्वारा परिष्कृत करलऽ जाय छै । विलायक मास्क क॑ प्रारंभिक 15Å लो-पास फिल्टर, 3 पिक्सेल मैप विस्तार आरू 3 पिक्सेल सॉफ्ट मास्क के उपयोग करी क॑ उत्पन्न करलऽ जाय छै । प्रति-कण सीटीएफ परिष्कार, प्रति-कण गति सुधार आरू प्रति-कण सीटीएफ परिष्कार केरऽ दोसरऽ दौर के उपयोग करी क॑ हर चरण के बाद 3D परिष्कार, विलायक मास्किंग आरू पोस्ट-प्रोसेसिंग करलऽ जाय छै ताकि परिणामस्वरूप बनावट क॑ आरू परिष्कृत करलऽ जाय सक॑ । 0.143 केरऽ एफएससी (फूरियर शेल सहसंबंध गुणांक) कट-ऑफ मान के उपयोग करी क॑ आरसी-एलएच114-डब्ल्यू आरू आरसी-एलएच116 केरऽ अंतिम मॉडल केरऽ रिजोल्यूशन क्रमशः 2.65 आरू 2.80Å छै । अंतिम मॉडल कें एफएससी वक्र कें चित्र 2. S17 मे दिखायल गेल छै.
सब प्रोटीन अनुक्रम UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt आईडी: Q6N9L5) स॑ डाउनलोड करलऽ जाय छै; LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); आर सी-एल (PufL; UniProt आईडी: O83005); आरसी-एम (PufM; UniProt आईडी: A0A4Z7); आर सी-एच (PuhA; UniProt आईडी: A0A4Z9); प्रोटीन-डब्ल्यू (PufW; UniProt आईडी: Q6N1K3)। SWISS-MODEL (45) केरऽ उपयोग आरसी केरऽ होमोलॉजी मॉडल के निर्माण लेली करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा म॑ आरसी-एल, आरसी-एम आरू आरसी-एच केरऽ प्रोटीन अनुक्रम आरू आरबीए केरऽ क्रिस्टल संरचना शामिल छै । sphaeroides आरसी क॑ टेम्पलेट (पीडीबी आईडी: 5एलएसई) (46) के रूप म॑ प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । यूसीएसएफ काइमेरा म॑ “फिट मैप” टूल के उपयोग करी क॑ जेनरेट करलऽ गेलऽ मॉडल क॑ नक्शा (47) प॑ फिट करलऽ जाय, प्रोटीन संरचना म॑ सुधार करलऽ जाय, आरू कोफैक्टर [4×BChl a (मोनोमर लाइब्रेरी अवशेष नाम = बीसीएल), 2×BPh a (BPH), एक या दू तरह के UQ10 (U10), एक गैर-हीम आयरन (Fe) आरू एक 3,4-डाइहाइड्रोहेक्साकार्बोनिल्कोलाइन (QAK)] जोड़य लेल कूट (48) के प्रयोग करू। चूँकि QAK मोनोमर लाइब्रेरी म॑ उपलब्ध नै छै, एकरा PHENIX (49) म॑ eLBOW टूल के उपयोग करी क॑ पैरामीटराइज करलऽ गेलऽ छेलै ।
आगू एलएच 1 सबयूनिट के निर्माण भेल। शुरू म॑ PHENIX (49) म॑ स्वचालित निर्माण उपकरण के उपयोग नक्शा आरू LH1-α आरू LH1-β प्रोटीन अनुक्रम क॑ इनपुट के रूप म॑ उपयोग करी क॑ LH1 अनुक्रम केरऽ कुछ हिस्सा के स्वचालित रूप स॑ निर्माण करै लेली करलऽ गेलऽ छेलै । सब सं पूरा LH1 सबयूनिट कें चयन करूं, ओकरा निकालूं आ ओकरा कूट मे लोड करूं, ओकरा मे गायब अनुक्रम कें मैन्युअल रूप सं जोड़ूं, आ दू BCls a (BCL) आ एकटा spirilloxanthin (CRT) कें जोड़य सं पहिले मैन्युअल रूप सं पूरा संरचना कें परिष्कृत करूं [संबंधित Rps कें अनुसार LH1 परिसर कें घनत्व आ ज्ञात कैरोटीनॉयड सामग्री. प्रजाति (17)]। पूरा LH1 सबयूनिट कें कॉपी करूं, आ LH1 घनत्व कें समीपस्थ गैर-मॉडल क्षेत्र मे डॉक करय कें लेल यूसीएसएफ काइमेरा “डॉकिंग मैप टूल” कें उपयोग करूं, आ ओकरा बाद ओकरा कूट मे परिष्कृत करूं; जाबे तइक सबटा एलएच1 सबयूनिट कें मॉडलिंग नहि भ गेल होय, तखन तइक इ प्रक्रिया दोहराउ. आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना के लेलऽ, कूट म॑ अनावंटित घनत्व निकाली क॑ प्रोटीन क॑ यूएससीएफ काइमेरा मैप म॑ शेष गैर-प्रोटीन घटकऽ स॑ विभाजित करलऽ जाय छै आरू ऑटोबिल्ड टूल के उपयोग प्रारंभिक मॉडल स्थापित करै लेली करलऽ जाय छै, आरू शेष सबयूनिट (प्रोटीन-डब्ल्यू) मॉडलिंग करलऽ जाय छै । फिनिक्स (49) में। कूट (48) मे परिणामस्वरूप मॉडल मे कोनों गायब अनुक्रम जोड़ू, आ फेर मैन्युअल रूप सं पूरा सबयूनिट कें परिष्कृत करू. शेष अनावंटित घनत्व लिपिड (सीडीएल = सीडीएल, पीओपीसी = 6पीएल आरू पीओपीजी = पीजीटी केरऽ पीडीबी मोनोमर लाइब्रेरी आईडी), बीटा-डीडीएम डिटर्जेंट (एलएमटी) आरू यूक्यू10 अणु (यू10) के संयोजन म॑ फिट बैठै छै । पूरा प्रारंभिक मॉडल कें सही करय कें लेल कूट (48) मे PHENIX अनुकूलन (49) आ मैनुअल अनुकूलन कें उपयोग करूं, जब तइक मॉडल आँकड़ा आ फिट कें दृश्य गुणवत्ता मे आ बेसि सुधार नहि कैल जा सकय छै. अंत मे, स्थानीय नक्शा कें तेज करय कें लेल LocScale (50) कें उपयोग करूं, आ ओकर बाद अनावंटित घनत्व आ स्वचालित आ मैनुअल अनुकूलन कें मॉडलिंग कें कई अन्य चक्र कें प्रदर्शन करूं.
अपनऽ-अपनऽ घनत्व के भीतर डॉक करलऽ गेलऽ संबंधित पेप्टाइड, कोफैक्टर आरू अन्य लिपिड आरू क्विनोन क॑ चित्र 1 आरू 2. S18 स॑ S23 म॑ दिखालऽ गेलऽ छै । अंतिम मॉडल कें सांख्यिकीय जानकारी तालिका S1 मे दिखायल गेल छै.
जब॑ तलक अन्यथा निर्दिष्ट नै करलऽ गेलऽ छै, यूवी/विस/एनआईआर अवशोषण स्पेक्ट्रा क॑ कैरी60 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (एजिलेंट, अमेरिका) प॑ 250 एनएम स॑ 1000 एनएम तलक के 1 एनएम अंतराल आरू 0.1s के एकीकरण समय प॑ एकत्रित करलऽ गेलऽ छेलै ।
नमूना क॑ क्वार्ट्ज क्यूवेट म॑ पतला करी क॑ 1 केरऽ A880 तलक 2 मिमी पथ के साथ, आरू 400 आरू 1000 एनएम के बीच अवशोषण स्पेक्ट्रम इकट्ठा करलऽ जाय । गोलाकार द्विवर्णीय स्पेक्ट्रा क॑ जास्को 810 स्पेक्ट्रोपोलारिमीटर (जास्को, जापान) प॑ 400 एनएम आरू 950 एनएम के बीच 1 एनएम अंतराल प॑ 20 एनएम मिनट-1 के स्कैन दर स॑ एकत्रित करलऽ गेलऽ छेलै ।
मोलर विलुप्त होय के गुणांक कोर परिसर क॑ लगभग 50 के A880 तलक पतला करी क॑ निर्धारित करलऽ जाय छै.10μl आयतन क॑ 990μl बाइंडिंग बफर या मेथनॉल म॑ पतला करी क॑, आरू BChl अपघटन क॑ कम स॑ कम करै लेली अवशोषण स्पेक्ट्रम क॑ तुरंत एकत्रित करी क॑ करलऽ जाय छै । प्रत्येक मेथनॉल नमूना केरऽ BChl सामग्री केरऽ गणना 54.8 एमएम-1 सेमी-1 केरऽ 771 एनएम प॑ विलुप्त होय के गुणांक द्वारा करलऽ गेलऽ छेलै, आरू विलुप्त होय के गुणांक निर्धारित करलऽ गेलऽ छेलै (51) । कोर जटिल सांद्रता निर्धारित करय कें लेल मापल गेलय BChl सांद्रता कें 32 (RC-LH114-W) या 36 (RC-LH116) सं विभाजित करूं, जेकर उपयोग तखन बफर विलुप्त होय कें गुणांक मे एकत्रित वही नमूना कें अवशोषण स्पेक्ट्रम कें निर्धारण करय कें लेल करल जाय छै. समानांतर। प्रत्येक नमूना के लेलऽ तीन बार-बार मापन करलऽ गेलऽ छेलै, आरू गणना लेली BChl Qy अधिकतम के औसत अवशोषण के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै । 878 एनएम प॑ मापलऽ गेलऽ आरसी-एलएच114-डब्ल्यू केरऽ विलुप्त होय के गुणांक 3280±140 एमएम-1 सेमी-1 छै, जबकि 880 एनएम प॑ मापलऽ गेलऽ आरसी-एलएच116 केरऽ विलुप्त होय के गुणांक 3800±30 एमएम-1 सेमी-1 छै ।
UQ10 कें मात्रा (52) मे देल गेल विधि कें अनुसार कैल गेलय. संक्षेप म॑ कहलऽ जाय त॑ एजिलेंट १२०० एचपीएलसी सिस्टम के उपयोग करी क॑ रिवर्स फेज एचपीएलसी (आरपी-एचपीएलसी) करलऽ गेलऽ छेलै । 0.02% (w/v) फेरिक क्लोराइड युक्त 50:50 मेथनॉल:क्लोरोफॉर्म मे लगभग 0.02 एनएमओएल आरसी-एलएच116 या आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कें 50μl मे घोलूं, आ पूर्व-संतुलित बेकमैन कल्टर अल्ट्रास्फीयर ओडीएस 4.6 मिमी एचपीएलसी मे 40 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर-1 मिनट-1 मे घोलूं विलायक (80:20 मेथनॉल: 2-प्रोपानोल) एक × 25 सेमी कॉलम पर। 275 एनएम (UQ10), 450 एनएम (कैरोटीनॉयड) आ 780 एनएम (BChl) पर 1 घंटा तइक अवशोषण कें निगरानी कें लेल एचपीएलसी विलायक मे आइसोक्रेटिक इल्यूशन करूं. 25.5 मिनट पर 275 एनएम क्रोमैटोग्राम म॑ पीक क॑ एकीकृत करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा म॑ कोनो अन्य पता लगाय सकै वाला यौगिक नै छेलै । एकीकृत क्षेत्र कें उपयोग 0 सं 5.8 एनएमओएल (चित्र S14) तइक कें शुद्ध मानक कें इंजेक्शन सं गणना कैल गेल अंशांकन वक्र कें संदर्भ मे निकालल गेलय UQ10 कें मोलर मात्रा कें गणना करय कें लेल करल जाय छै. प्रत्येक नमूना कें तीन प्रतिलिपि मे विश्लेषण कैल गेलय, आ रिपोर्ट कैल गेल त्रुटि औसत कें एसडी सं मेल खायत छै.
0.1 केरऽ अधिकतम Qy अवशोषण वाला आरसी-एलएच1 परिसर वाला घोल क॑ 30 μM रिड्यूस्ड हॉर्स हार्ट साइटोक्रोम c2 (मर्क, यूके) आरू 0 स॑ 50 μMUQ2 (मर्क, यूके) स॑ तैयार करलऽ गेलऽ छेलै । प्रत्येक UQ2 सांद्रता पर तीन 1-एमएल नमूना तैयार कैल गेलय आ 4°C पर अन्हार मे रात भर इन्क्यूबेट कैल गेलय ताकि माप सं पहिले अन्हार मे पूरा अनुकूलन सुनिश्चित कैल जा सकय. घोल क॑ ओलिस आरएसएम1000 मॉड्यूलर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर म॑ लोड करलऽ गेलऽ छेलै जे 300 एनएम लौ/500 लाइन ग्रेटिंग, 1.24 मिमी इनलेट, 0.12 मिमी बीच आरू 0.6 मिमी आउटलेट स्लिट स॑ लैस छेलै । नमूना फोटोट्यूब आरू संदर्भ फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब केरऽ प्रवेश द्वार प॑ 600 एनएम लंबा पास फिल्टर रखलऽ जाय छै ताकि उत्तेजना प्रकाश क॑ बाहर करलऽ जाय सक॑ । अवशोषण क॑ 0.15 s के एकीकरण समय के साथ 550 एनएम प॑ निगरानी करलऽ गेलऽ छेलै । उत्तेजना प्रकाश 880 एनएम M880F2 एलईडी (लाइट इमिटिंग डायोड) (Thorlabs Ltd., UK) स॑ फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम स॑ 90% तीव्रता प॑ DC2200 नियंत्रक (Thorlabs Ltd., UK) के माध्यम स॑ उत्सर्जित होय छै आरू प्रकाश स्रोत प॑ 90° के कोण प॑ उत्सर्जित होय छै । मापऽ वाला बीम दर्पण के विपरीत होय छै ताकि कोनो भी प्रकाश वापस करलऽ जाय सक॑ जे शुरू म॑ नमूना द्वारा अवशोषित नै करलऽ गेलऽ छेलै । 50 s के प्रकाशमानता स 10 s पहिने अवशोषण के निगरानी करू। तखन अन्हार मे 60 s तइक अवशोषण कें आगू निगरानी कैल गेलय ताकि इ आकलन कैल जा सकय कि क्विनोलोल अनायास साइटोक्रोम c23 + कें कतेक हद तक कम करय छै (कच्चा आंकड़ा कें लेल चित्र S8 देखू)।
0.5 स॑ 10 s के भीतर रैखिक प्रारंभिक दर (यूक्यू2 सांद्रता के आधार प॑) फिट करी क॑ आरू हर यूक्यू2 सांद्रता प॑ तीनों नमूना के दर के औसतन करी क॑ डाटा क॑ संसाधित करलऽ गेलऽ छेलै । संबंधित विलुप्त होय के गुणांक द्वारा गणना करलऽ गेलऽ आरसी-एलएच1 सांद्रता के उपयोग दर क॑ उत्प्रेरक दक्षता म॑ बदलै लेली करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा ओरिजिन प्रो 2019 (ओरिजिनलैब, अमेरिका) म॑ प्लॉट करलऽ गेलऽ छेलै, आरू माइकेलिस-मेन्टेन मॉडल म॑ फिट करलऽ गेलऽ छेलै ताकि स्पष्ट किमी आरू केकैट मान निर्धारित करलऽ जाय सक॑ ।
क्षणिक अवशोषण मापन के लेलऽ आरसी-एलएच1 नमूना क॑ आईएमएसी बफर म॑ ~2μM तलक पतला करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ 50 एमएम सोडियम एस्कॉर्बेट (मर्क, अमेरिका) आरू 0.4 एमएम टर्बुटिन (मर्क, अमेरिका) छेलै । एस्कॉर्बिक एसिड क॑ बलिदान इलेक्ट्रॉन दाता के रूप म॑ प्रयोग करलऽ जाय छै, आरू टर्ट-ब्यूटाक्लोफेन के उपयोग क्यूबी अवरोधक के रूप म॑ करलऽ जाय छै ताकि ई सुनिश्चित करलऽ जाय सक॑ कि मुख्य आरसी दाता पूरा मापन प्रक्रिया म॑ कम होय जाय छै (अर्थात फोटोऑक्सीडाइज नै होय जाय) । लगभग 3 मिलीलीटर नमूना क॑ 2 मिमी ऑप्टिकल पथ लंबाई वाला कस्टम घूमऽ वाला कोशिका (लगभग 0.1 मीटर व्यास, 350 आरपीएम) म॑ मिलालऽ जाय छै ताकि ई सुनिश्चित करलऽ जाय सक॑ कि लेजर पथ म॑ नमूना क॑ उत्तेजना नाड़ी के बीच डार्क अनुकूलन लेली पर्याप्त समय मिल॑ सक॑ । Ti: Sapphire लेजर सिस्टम (स्पेक्ट्रा फिजिक्स, अमेरिका) क॑ प्रवर्धित करै लेली ~100-fs लेजर पल्स के उपयोग करी क॑ नमूना क॑ 880 nm प॑ 1 kHz (NIR लेली 20 nJ या Vis लेली 100 nJ) के पुनरावृत्ति दर प॑ उत्तेजित करलऽ जाय । डाटा एकत्रित करय सं पहिले नमूना कें लगभग 30 मिनट तइक उत्तेजना प्रकाश मे राखूं. एक्सपोजर सं क्यूए निष्क्रिय भ जेतय (संभवतः एक या दू बेर क्यूए कें कम भ जेतय)। लेकिन कृपया ध्यान राखब जे ई प्रक्रिया उलटय योग्य अछि कियाकि लंबा अवधि के डार्क एडैप्टेशन के बाद आरसी धीरे-धीरे क्यूए एक्टिविटी में वापस आबि जायत. -10 स॑ 7000 पीएस के विलंब समय के साथ क्षणिक स्पेक्ट्रा क॑ मापै लेली हेलियोस स्पेक्ट्रोमीटर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम्स, अमेरिका) के प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । डाटा सेट कें अनग्रुप करय कें लेल सरफेस एक्सप्लोरर सॉफ्टवेयर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम्स, अमेरिका) कें उपयोग करूं, तखन मर्ज आ मानकीकरण करूं. क्षय स॑ संबंधित विभेदक स्पेक्ट्रा प्राप्त करै लेली संयुक्त डाटा सेट के उपयोग करै लेली CarpetView सॉफ्टवेयर पैकेज (लाइट रूपांतरण लिमिटेड, लिथुआनिया) के उपयोग करऽ, या एक ऐन्हऽ फंक्शन के उपयोग करऽ जे मूल (OriginLab, USA) म॑ एकल-तरंग दैर्ध्य स्पेक्ट्रल विकास क॑ फिट करै लेली साधन प्रतिक्रिया के साथ कई घातांक क॑ घुमाबै छै ।
जैना कि ऊपर कहलऽ गेलऽ छै (53), एक प्रकाश संश्लेषण फिल्म तैयार करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ एलएच 1 परिसर छेलै जेकरा म॑ आरसी आरू परिधीय एलएच 2 एंटीना दूनू के कमी छेलै । झिल्ली क॑ 20 एमएम ट्राइस (पीएच 8.0) म॑ पतला करलऽ गेलऽ छेलै आरू ओकरा बाद 2 मिमी ऑप्टिकल पथ वाला क्वार्ट्ज क्यूवेट म॑ लोड करलऽ गेलऽ छेलै । नमूना क॑ 540 एनएम प॑ उत्तेजित करै लेली 30nJ लेजर पल्स के प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै जेकरऽ विलंब समय -10 स॑ 7000 पीएस छेलै । आरपीएस कें लेल वर्णित कें अनुसार डाटा सेट कें संसाधित करूं. पाल नमूना।
झिल्ली क॑ 4°C प॑ 2 घंटा तलक 150,000 RCF प॑ अपकेंद्रित्रण द्वारा गोली बनालऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद 880 एनएम प॑ एकरऽ अवशोषण क॑ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) आरू 200 mM NaCl म॑ पुनः निलंबित करलऽ गेलऽ छेलै । 4°C पर अन्हार मे 1 घंटा तक 2% (w/v) β-DDM मे धीरे-धीरे हिला कए झिल्ली कए घोल दियौ । नमूना क॑ 100 एमएम ट्राइएथिल अमोनियम कार्बोनेट (पीएच 8.0) (टीईएबी; मर्क, यूके) म॑ 2.5 मिलीग्राम एमएल-1 (बायो-रैड विश्लेषण) के प्रोटीन सांद्रता तलक पतला करलऽ गेलऽ छेलै । आगू के प्रसंस्करण पहिने प्रकाशित विधि (54) स॑ करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा म॑ 50 μg प्रोटीन क॑ कुल 50 μl TEAB म॑ पतला करला स॑ शुरू करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ 1% (w/v) सोडियम लॉरेट (Merck, UK) छेलै । 60 s के लिए sonication के बाद, यह 30 मिनट के लिए 37 ° C पर 5 एमएम tris (2-carboxyethyl) phosphine (Merck, यूके) के साथ कम करलऽ गेलऽ छेलै । एस-एलकाइलेशन कें लेल नमूना कें 10 एमएम मिथाइल एस-मिथाइलथियोमेथेनसल्फोनेट (मर्क, यूके) सं इन्क्यूबेट करूं आ ओकरा 200 एमएम आइसोप्रोपानोल स्टॉक घोल सं कमरा कें तापमान पर 10 मिनट तइक मिलाऊं. प्रोटीओलाइटिक पाचन 2 μg ट्रिप्सिन/एन्डोप्रोटीनेज Lys-C मिश्रण (Promega UK) मिला क 37°C पर 3 घंटा तइक इन्क्यूबेट कैल गेलय. लॉरेट सरफैक्टेंट क॑ 50 μl एथिल एसीटेट आरू 10 μl 10% (v/v) एलसी ग्रेड ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (TFA; थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) मिला क॑ 60 s तलक भंवर लगाय क॑ निकाललऽ गेलऽ छेलै । चरण पृथक्करण क॑ 15,700 आरसीएफ प॑ 5 मिनट तलक अपकेंद्रित्रण द्वारा बढ़ावा देलऽ गेलऽ छेलै । निर्माता केरऽ प्रोटोकॉल के अनुसार पेप्टाइड वाला निचला चरण क॑ सावधानी स॑ एस्पिरेट करी क॑ डिसाल्ट करै लेली सी१८ स्पिन कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) के इस्तेमाल करलऽ गेलऽ छेलै । वैक्यूम अपकेंद्रित्रण द्वारा सुखाय के बाद नमूना क॑ 0.5% टीएफए आरू 3% एसीटोनिट्राइल म॑ घोललऽ गेलऽ छेलै, आरू 500 एनजी क॑ नैनोफ्लो आरपी क्रोमैटोग्राफी स॑ जोड़लऽ गेलऽ मास स्पेक्ट्रोमेट्री स॑ पहल॑ विस्तृत सिस्टम पैरामीटर के उपयोग करी क॑ विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै ।
आरपीएस कें खोज करय कें लेल प्रोटीन पहचान आ मात्रा निर्धारण कें लेल MaxQuant v.1.5.3.30 (56) कें उपयोग करूं. palustris प्रोटीओम डाटाबेस (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीओमिक्स डाटा क॑ डाटासेट पहचानकर्ता पीएक्सडी०२०४०२ के तहत प्राइड पार्टनर रिपोजिटरी (http://proteomecentral.proteomexchange.org) के माध्यम स॑ प्रोटीओमएक्सचेंज एलायंस म॑ जमा करलऽ गेलऽ छै ।
इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित आरपीएलसी द्वारा विश्लेषण के लेलऽ आरसी-एलएच1 परिसर क॑ जंगली प्रकार के आरपीएस स॑ तैयार करलऽ गेलऽ छेलै । पहिने प्रकाशित विधि (16) के उपयोग स॑, पलुस्ट्रिस कोशिका म॑ उत्पादित प्रोटीन सांद्रता 20 एमएम हेपस (पीएच 7.8), 100 एमएम NaCl आरू 0.03% (w/v) β- (बायो-रैड विश्लेषण) ) डीडीएम म॑ 2 मिलीग्राम एमएल-1 छेलै । निर्माता कें प्रोटोकॉल कें अनुसार, अवक्षेपण विधि सं 10 μg प्रोटीन निकालय कें लेल 2D शुद्धिकरण किट (जीई हेल्थकेयर, अमेरिका) कें उपयोग करूं, आ अवक्षेप कें 20 μl 60% (v / v) फॉर्मिक एसिड (FA), 20% (v / v) एसीटोनिट्राइल आ 20% (v/v) पानी मे घोलूं. पांच माइक्रोलीटर के विश्लेषण आरपीएलसी (डायोनेक्स आरएसएलसी) द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मैक्सिस यूएचआर-टीओएफ, ब्रूकर) के साथ युग्मित करलऽ गेलऽ छेलै । 60°C आ 100μlmin -1 पर पृथक्करण कें लेल MabPac 1.2×100 मिमी कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) कें उपयोग करूं, जइ मे 85% (v / v) विलायक A [0.1% (v / v) FA आ 0.02% (V/v) TFA जलीय घोल] सं 85%(v/v) विलायक B कें ढाल होयत छै [90%(v/v) एसीटोनिट्राइल टीएफए म॑ 0.1%(v/v) FA आरू 0.02%(v/v)] 60 मिनट स॑ अधिक समय तलक मानक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत आरू डिफ़ॉल्ट पैरामीटर के उपयोग करी क॑ मास स्पेक्ट्रोमीटर 100 स॑ 2750 m/z (मास-टू-चार्ज अनुपात) प्राप्त करै छै । ExPASy जैव सूचना विज्ञान संसाधन पोर्टल FindPept उपकरण (https://web.expasy.org/findpept/) कें मदद सं, परिसर कें उप-इकाइयक कें लेल जन स्पेक्ट्रम कें मैप करूं.
कोशिका क॑ 100 मिलीलीटर एनएफ-कम (10μMm-2 s-1), मध्यम (30μMm-2 s-1) या उच्च (300μMm-2 s-1) प्रकाश के तहत 72 घंटा तलक बढ़ालऽ गेलऽ छेलै । M22 माध्यम (M22 माध्यम जइ मे अमोनियम सल्फेट छोड़ल गेल छै आ सोडियम सुसिनेट कें स्थान पर सोडियम एसीटेट राखल गेल छै) 100 मिलीलीटर कें स्क्रू-टॉप बोतल (23) मे. पांच 30-s चक्र म॑ 0.1 माइक्रोन ग्लास बीड्स क॑ कोशिका क॑ लाइस करै लेली 1:1 के आयतन अनुपात प॑ बीड करलऽ गेलऽ छेलै आरू बर्फ प॑ 5 मिनट तलक ठंडा करलऽ गेलऽ छेलै । अघुलनशील पदार्थ, अटूट कोशिका आरू कांच के बीड्स क॑ बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज म॑ 16,000 आरसीएफ प॑ 10 मिनट तलक अपकेंद्रित्रण द्वारा हटाय देलऽ गेलऽ छेलै । झिल्ली क॑ 40/15% (w/w) सुक्रोज ढाल के साथ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) म॑ 100,000 RCF के साथ Ti 70.1 रोटर म॑ 10 घंटा तलक अलग करलऽ गेलऽ छेलै ।
जैसऽ कि हमरऽ पिछला काम म॑ वर्णित छै, PufW (16) प॑ His टैग केरऽ इम्यूनोडिटेक्शन । संक्षेप म॑ कहलऽ जाय त॑ शुद्ध कोर परिसर (11.8 एनएम) या 2x एसडीएस लोडिंग बफर (मर्क, यूके) म॑ आरसी केरऽ समान सांद्रता वाला झिल्ली (कम करलऽ गेलऽ अंतर स्पेक्ट्रम क॑ घटाय क॑ ऑक्सीकरण द्वारा निर्धारित करलऽ जाय छै आरू दागदार जेल प॑ भार स॑ मेल खाबै छै) क॑ दू बार पतला करलऽ गेलऽ छेलै । प्रोटीन क॑ प्रतिकृति 12% बिस्-ट्रिस नुपेज जेल (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) प॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै । आरसी-एल सबयूनिट क॑ लोड आरू विजुअलाइज करै लेली एक जेल क॑ कूमासी ब्रिलियंट ब्लू (बायो-रैड, यूके) स॑ रंगलऽ गेलऽ छेलै । दोसरऽ जेल प॑ मौजूद प्रोटीन क॑ इम्यूनोएसे लेली मेथनॉल-सक्रिय पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) म॑ स्थानांतरित करलऽ गेलऽ छेलै । पीवीडीएफ झिल्ली क॑ 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.6), 150 एमएम NaCl, 0.2% (v / v) ट्वीन-20 आरू 5% (w / v) स्किम्ड दूध पाउडर म॑ अवरुद्ध करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद एंटी-हिस प्राथमिक एंटीबॉडी (में डिल्यूट एंटीबॉडी बफर [50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.6) म॑) के साथ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । 150 mM NaCl आरू 0.05% (v/v) Tween-20] क॑ 1:1000 A190-114A, बेथाइल लैबोरेटरीज, अमेरिका) म॑ 4 घंटा तलक । एंटीबॉडी बफर म॑ 5 मिनट तलक 3 बार धोला के बाद, झिल्ली क॑ हॉर्सरैडिश पेरोक्साइडेज (सिग्मा-एल्ड्रिच, यूके) एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी (एंटीबॉडी बफर म॑ 1:10,000 पतला करलऽ गेलऽ) के साथ संयोजित करलऽ गेलऽ छेलै ताकि पता लगाबै के अनुमति मिल॑ सक॑ (एंटीबॉडी बफर म॑ 3 बार धोला के बाद 5 मिनट बाद) WESTAR ETA C 2.0 केमिलुमिनसेंस सब्सट्रेट के उपयोग करी क॑ (सियानाजेन, इटली) आ अमेरशम इमेजर 600 (जीई हेल्थकेयर, यूके)।
प्रत्येक रंगीन जेल या इम्यूनोएसे लेन के तीव्रता वितरण क॑ आकर्षित करी क॑, चोटी के नीचे के क्षेत्र क॑ एकीकृत करी क॑ आरू आरसी-एल (दागदार जेल) आरू प्रोटीन-डब्ल्यू (इम्यूनोएसे) के तीव्रता अनुपात के गणना करी क॑, इमेजजे (57) म॑ छवि क॑ संसाधित करी क॑ । ई अनुपात क॑ मोलर अनुपात म॑ बदललऽ गेलऽ छेलै, ई मानतें हुअ॑ कि शुद्ध आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू नमूना म॑ आरसी-एल आरू प्रोटीन-डब्ल्यू के अनुपात १:१ छेलै आरू तदनुसार पूरा डाटा सेट क॑ सामान्य करलऽ गेलऽ छेलै ।
एहि लेख के लेल पूरक सामग्री के लेल कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 देखू
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डेविड जे के Swainsbury, पार्क कियान, फिलिप जे जैक्सन, कैटलिन एम Faries, Dariusz एम Niedzwiedzki, एलिजाबेथ सी मार्टिन, डेविड ए किसान, लोर्ना ए मेलोन, रेबेका एफ थॉम्पसन, नील ए रैंसन, डेनियल पी Canniffe , मार्क जे Dickman, डेवी Holten, क्रिस्टीन Kirmaier, एंड्रयू Hitchcock, सी नील हंटर
प्रतिक्रिया केंद्र म॑ प्रकाश जाल १ परिसर केरऽ उच्च रिजोल्यूशन संरचना स॑ क्विनोन गतिशीलता के बारे म॑ नया जानकारी मिलै छै ।
डेविड जे के Swainsbury, पार्क कियान, फिलिप जे जैक्सन, कैटलिन एम Faries, Dariusz एम Niedzwiedzki, एलिजाबेथ सी मार्टिन, डेविड ए किसान, लोर्ना ए मेलोन, रेबेका एफ थॉम्पसन, नील ए रैंसन, डेनियल पी Canniffe , मार्क जे Dickman, डेवी Holten, क्रिस्टीन Kirmaier, एंड्रयू Hitchcock, सी नील हंटर
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