वर्तमान *वर्तमान पता: कोलोन 50931, जर्मनी, कोलोन एक्सीलेंस क्लस्टर रिसर्च ऑन सेलुलर तनाव रिस्पॉन्स इन एजिंग-रिलेटेड डिजीज (सीईसीएडी) |
माइटोकॉन्ड्रिया रोग केरऽ न्यूरोडीजनरेशन क॑ अपरिवर्तनीय मानलऽ जाय छै, कैन्हेंकि न्यूरॉन्स केरऽ चयापचय प्लास्टिसिटी सीमित होय छै, लेकिन शरीर म॑ न्यूरॉनल मेटाबोलिज्म केरऽ कोशिका स्वायत्तता प॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार केरऽ प्रभाव के बारे म॑ बहुत कम जानकारी छै । यहाँ, हम बाधित माइटोकॉन्ड्रिया संलयन गतिशीलता के कारण प्रगतिशील OXPHOS कमी के साथ Purkinje न्यूरॉन्स के कोशिका-विशिष्ट प्रोटीओम परिचय. हमनें पाया कि माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार न॑ प्रोटीओमिक्स के क्षेत्र म॑ गहन परिवर्तन के ट्रिगर करलकै, जेकरा स॑ अंततः कोशिका केरऽ मृत्यु स॑ पहल॑ सटीक चयापचय कार्यक्रम के क्रमिक सक्रियता पैदा होय गेलै । अप्रत्याशित रूप स॑, हमन॑ पाइरुवेट कार्बोक्जिलेज (PCx) आरू अन्य एंटी-एजिंग एंजाइम केरऽ स्पष्ट प्रेरण निर्धारित करलकै जे टीसीए चक्र केरऽ मध्यवर्ती पदार्थ के पूरक छै । पीसीएक्स केरऽ निरोध न॑ ऑक्सीडेटिव तनाव आरू न्यूरोडिजनरेशन क॑ बढ़ा देलकै, जे ई दर्शाबै छै कि ऑक्सफोस के कमी वाला न्यूरॉन्स म॑ धमनीकाठिन्य के सुरक्षात्मक प्रभाव छै । अंतिम रूप स॑ क्षीण न्यूरॉन्स म॑ माइटोकॉन्ड्रिया संलयन केरऽ बहाली ई चयापचय विशेषता क॑ पूरा तरह स॑ उलटै छै, जेकरा स॑ कोशिका केरऽ मृत्यु नै होय जाय छै । हमरऽ निष्कर्ष पहिने स॑ अज्ञात मार्गऽ के पहचान करै छै जे माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार के प्रति लचीलापन प्रदान करै छै आरू ई दर्शाबै छै कि न्यूरोडिजनरेशन क॑ बीमारी केरऽ अंतिम दौर म॑ भी उलटलऽ जाब॑ सकै छै ।
न्यूरॉनल ऊर्जा चयापचय क॑ बनाए रखै म॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ केंद्रीय भूमिका प॑ मानव माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ बीमारी स॑ जुड़लऽ व्यापक न्यूरोलॉजिकल लक्षणऽ स॑ जोर देलऽ गेलऽ छै । ई बीमारी म॑ स॑ अधिकांश जीन उत्परिवर्तन के कारण होय छै जे माइटोकॉन्ड्रिया जीन अभिव्यक्ति (1, 2) या माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता स॑ संबंधित जीन विनाश क॑ नियंत्रित करै छै, जे अप्रत्यक्ष रूप स॑ माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए (mtDNA) (3, 4) के स्थिरता क॑ प्रभावित करै छै । जानवरऽ के मॉडल म॑ काम स॑ पता चललै छै कि आसपास के ऊतकऽ म॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार के प्रतिक्रिया म॑ रूढ़िवादी चयापचय मार्ग (5-7) क॑ सक्रिय करलऽ जाब॑ सकै छै, जे ई जटिल बीमारियऽ के रोगजनन के गहन समझ लेली महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करै छै । एकरऽ बिल्कुल विपरीत, मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया एडेनोसाइने ट्राइफॉस्फेट (ATP) उत्पादन केरऽ सामान्य विफलता के कारण विशिष्ट कोशिका प्रकार के चयापचय परिवर्तन के बारे म॑ हमरऽ समझ मौलिक छै (8), जेकरा म॑ चिकित्सीय लक्ष्य के पहचान करै के जरूरत प॑ जोर देलऽ गेलऽ छै जेकरऽ उपयोग बीमारी क॑ रोकै या रोकै लेली करलऽ जाब॑ सकै छै । न्यूरोडिजनरेशन (9) के रोकथाम। जानकारी के कमी ई तथ्य छै कि तंत्रिका कोशिका क॑ व्यापक रूप स॑ आसपास के ऊतकऽ के कोशिका प्रकार के तुलना म॑ बहुत सीमित चयापचय के लचीलापन मानलऽ जाय छै ( 10 ). ई देखत॑ कि ई कोशिका सिनैप्टिक संचरण क॑ बढ़ावा दै लेली आरू चोट आरू बीमारी के स्थिति के प्रति प्रतिक्रिया दै लेली न्यूरॉन्स म॑ मेटाबोलाइट्स के आपूर्ति के समन्वय म॑ केंद्रीय भूमिका निभाबै छै, मस्तिष्क के ऊतक के चुनौतीपूर्ण परिस्थिति म॑ कोशिका चयापचय क॑ अनुकूलित करै के क्षमता लगभग ग्लिया कोशिका तलक सीमित छै (11-14) । एकरऽ अलावा, मस्तिष्क के ऊतक केरऽ अंतर्निहित कोशिकीय विषमता काफी हद तलक चयापचय परिवर्तन के अध्ययन म॑ बाधा पहुँचै छै जे विशिष्ट न्यूरॉनल उपसमूह म॑ होय छै । एकरऽ परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स म॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार केरऽ सटीक कोशिकीय आरू चयापचय संबंधी परिणाम के बारे म॑ बहुत कम जानकारी छै ।
माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार केरऽ चयापचय परिणाम क॑ समझै लेली, हमन॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ बाहरी झिल्ली संलयन (Mfn2) केरऽ विनाश के कारण न्यूरोडिजनरेशन केरऽ विभिन्न चरणऽ म॑ पुर्किन्जे न्यूरॉन्स (पीएन) क॑ अलग करलकै । यद्यपि मनुष्य म॑ Mfn2 उत्परिवर्तन वंशानुगत मोटर संवेदी न्यूरोपैथी केरऽ एक रूप स॑ जुड़लऽ छै जेकरा Charcot-Marie-Tooth type 2A (15) के नाम स॑ जानलऽ जाय छै, लेकिन चूहा म॑ Mfn2 केरऽ सशर्त विनाश ऑक्सीकरण फॉस्फोरिलेशन (OXPHOS) विकार विधि केरऽ एगो सुप्रसिद्ध प्रेरण छै । विभिन्न न्यूरॉनल उपप्रकार (16-19) आरू परिणामस्वरूप न्यूरोडिजनरेटिव फेनोटाइप के साथ प्रगतिशील न्यूरोलॉजिकल लक्षण भी होय छै, जेना कि आंदोलन विकार (18, 19) या सेरिबेलर अटैक्सिया (16) । लेबल-मुक्त मात्रात्मक (LFQ) प्रोटीओमिक्स, मेटाबोलोमिक्स, इमेजिंग, आरू वायरलॉजिकल विधियऽ के संयोजन के उपयोग करी क॑ हम्मं॑ ई दर्शाबै छियै कि प्रगतिशील न्यूरोडिजनरेशन मजबूती स॑ पाइरुवेट कार्बोक्जिलेज (PCx) आरू अन्य कारक क॑ प्रेरित करै छै जे पीएन केरऽ धमनीकाठिन्य म॑ शामिल छै इन विवो म॑ एंजाइम केरऽ अभिव्यक्ति । ई निष्कर्ष केरऽ प्रासंगिकता क॑ सत्यापित करै लेली, हमन॑ विशेष रूप स॑ Mfn2-कमी वाला पीएन म॑ पीसीएक्स केरऽ अभिव्यक्ति क॑ डाउन-रेगुलेट करलकै, आरू पालै छै कि ई ऑपरेशन न॑ ऑक्सीडेटिव तनाव क॑ बढ़ाबै आरू न्यूरोडिजनरेशन क॑ तेज करलकै, जेकरा स॑ ई साबित होय गेलै कि एजोस्पर्मिया कोशिका मृत्यु चयापचय अनुकूलन क्षमता प्रदान करै छै । MFN2 केरऽ गंभीर अभिव्यक्ति गंभीर OXPHOS कमी, माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए केरऽ भारी खपत, आरू प्रत्यक्ष रूप स॑ टूटलऽ माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क के साथ टर्मिनल डिजनरेशन पीएन क॑ पूरा तरह स॑ बचा सकै छै, जे आरू ई बात प॑ जोर दै छै कि न्यूरोडिजनरेशन केरऽ ई रूप कोशिका केरऽ मृत्यु स॑ पहल॑ बीमारी केरऽ उन्नत चरण म॑ भी ठीक होय सकै छै ।
Mfn2 नॉकआउट पीएन म॑ माइटोकॉन्ड्रिया क॑ विजुअलाइज करै के क्रम म॑, हमन॑ एक माउस तनाव के इस्तेमाल करलकै जे Cre-निर्भर माइटोकॉन्ड्रिया क॑ पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) (mtYFP) (20) Cre अभिव्यक्ति क॑ लक्षित करै के अनुमति दै छै आरू विवो म॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान के जांच करलकै । हमनें पाया कि पीएन म॑ Mfn2 जीन केरऽ विनाश स॑ माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क केरऽ धीरे-धीरे विभाजन होय ​​जैतै (चित्र S1A), आरू सबसें जल्दी परिवर्तन 3 सप्ताह के उम्र म॑ मिललै । एकरऽ विपरीत, पीएन कोशिका परत केरऽ पर्याप्त क्षय, जेकरऽ प्रमाण कैलबिंडिन इम्यूनोस्टेनिंग केरऽ नुकसान स॑ मिलै छै, १२ सप्ताह के उम्र तलक शुरू नै होलै (चित्र १, ए आरू बी) । माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान म॑ सबसें शुरुआती परिवर्तन आरू न्यूरॉनल मृत्यु केरऽ दृश्यमान शुरुआत के बीच के समय के बेमेल न॑ हमरा कोशिका केरऽ मृत्यु स॑ पहल॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार स॑ शुरू होय वाला चयापचय परिवर्तन के जांच करै लेली प्रेरित करलकै । हमनें YFP (YFP +)-अभिव्यक्त पीएन (चित्र 1C) क॑ अलग करै लेली एक प्रतिदीप्ति-सक्रिय कोशिका छंटाई (FACS) आधारित रणनीति विकसित करलकै, आरू नियंत्रण चूहों (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) म॑, जेकरा स॑ आगू सीटीआरएल (चित्र S1B) के रूप म॑ संदर्भित करलऽ जाय छै । YFP संकेत केरऽ सापेक्षिक तीव्रता प॑ आधारित गेटिंग रणनीति केरऽ अनुकूलन हमरा गैर-पीएन (YFPneg) (चित्र S1B) या कथित फ्लोरोसेंट एक्सोन/डेंड्रिटिक टुकड़ा (YFPlow; चित्र S1D, बायां) स॑ पीएन केरऽ YFP + शरीर (YFPhigh) क॑ शुद्ध करै के अनुमति दै छै, जेकरऽ पुष्टि कॉनफोकल माइक्रोस्कोप (चित्र S1D, दाहिना) स॑ करलऽ गेलऽ छै । वर्गीकृत आबादी केरऽ पहचान के सत्यापन के क्रम म॑, हमन॑ एलएफक्यू प्रोटीओमिक्स आरू ओकरा बाद प्रिंसिपल घटक विश्लेषण करलकै, आरू पालै छै कि YFPhigh आरू YFPneg कोशिका के बीच स्पष्ट पृथक्करण छै (चित्र S1C) । YFPhigh कोशिका न॑ ज्ञात पीएनएस मार्कर (अर्थात Calb1, Pcp2, Grid2 आरू Itpr3) (21, 22) केरऽ शुद्ध संवर्धन दिखाय देलकै, लेकिन आमतौर प॑ न्यूरॉन्स या अन्य कोशिका प्रकार म॑ व्यक्त प्रोटीन केरऽ कोनों संवर्धन नै देखैलकै (चित्र 1D)) । स्वतंत्र प्रयोगों म॑ एकत्रित वर्गीकृत YFPhigh कोशिका म॑ नमूना के बीच एक तुलना न॑ एक सहसंबंध गुणांक> 0.9 देखैलकै, जे जैविक प्रतिकृति के बीच अच्छा प्रजनन क्षमता क॑ दर्शाबै छै (चित्र S1E) । संक्षेप मे, इ आंकड़ा व्यवहार्य पीएन कें तीव्र आ विशिष्ट अलगाव कें लेल हमर योजना कें मान्यता देलक. चूँकि प्रयोग करलऽ गेलऽ L7-cre ड्राइवर प्रणाली प्रसव (23) के बाद पहलऽ सप्ताह म॑ मोज़ेक पुनर्संयोजन क॑ प्रेरित करै छै, हमन॑ सीटीआरएल आरू सशर्त (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) न्यूरॉन्स इकट्ठा करै स॑ चूहा क॑ कलिंग करना शुरू करलकै । पुनर्संयोजन पूरा भेलाक बाद एकरा 4 सप्ताहक उम्र मे Mfn2cKO कहल जाइत अछि । अंतिम बिंदु के रूप में, हमनें 8 सप्ताह के उम्र चुनलकै जबे पीएन परत स्पष्ट माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन के बावजूद बरकरार छेलै (चित्र 1B आरू चित्र S1A) । कुल मिला क॑, हमन॑ कुल 3013 प्रोटीन केरऽ मात्रा निर्धारित करलकै, जेकरा म॑ स॑ लगभग 22% माइटोकॉन्ड्रिया (चित्र 1E) (चित्र 1E) (24) के रूप म॑ माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीओम प॑ आधारित माइटोकार्टा 2.0 एनोटेशन प॑ आधारित छेलै । सप्ताह 8 म॑ करलऽ गेलऽ विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण स॑ पता चललै कि सब प्रोटीनऽ म॑ स॑ केवल 10.5% म॑ महत्वपूर्ण परिवर्तन (चित्र 1F आरू चित्र S1F) छेलै, जेकरा म॑ स॑ 195 प्रोटीन डाउन-रेगुलेटेड आरू 120 प्रोटीन अप-रेगुलेटेड छेलै (चित्र 1F) । ध्यान देबऽ के बात छै कि ई डाटा सेट केरऽ “अभिनव मार्ग विश्लेषण” स॑ पता चलै छै कि अंतर स॑ अभिव्यक्त जीन मुख्य रूप स॑ विशिष्ट चयापचय मार्ग केरऽ प्रतिबंधित सेट स॑ संबंधित छै (चित्र 1G) । दिलचस्प बात ई छै कि यद्यपि OXPHOS आरू कैल्शियम सिग्नलिंग स॑ संबंधित मार्गऽ के डाउनरेगुलेशन फ्यूजन-कमी वाला पीएन म॑ माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन के प्रेरण के पुष्टि करै छै, लेकिन अन्य श्रेणी जेकरा म॑ मुख्य रूप स॑ अमीनो एसिड चयापचय शामिल छै, काफी अपरेगुलेट होय जाय छै, जे माइटोकॉन्ड्रिया म॑ घटित चयापचय के अनुरूप छै रिवायरिंग लगातार छै । विकार।
(ए) CTRL आरू Mfn2cKO चूहों के सेरिबेलर खंडों के प्रतिनिधि कॉनफोकल फोटोग्राफ जे पीएन (कैल्बिंडिन, ग्रे) के प्रगतिशील नुकसान दिखाते हैं; नाभिक डीएपीआई के साथ काउंटरस्टेन करलऽ गेलऽ छेलै । (B) (A) के मात्रा निर्धारण (विचरण के एकतरफा विश्लेषण, *** पी <0.001; n = तीन चूहों से 4 से 6 वृत्त)। (ग) प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह। (D) पुर्किन्जे (ऊपर) एवं अन्य कोशिका प्रकार (मध्य) के लिये विशिष्ट मार्करों का हीट मैप वितरण | (E) वेन आरेख जे वर्गीकृत पीएन मे पहचानल गेल माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन कें संख्या कें दर्शा रहल छै. (F) 8 सप्ताह (1.3 के महत्व कट-ऑफ मान) पर Mfn2cKO न्यूरॉन्स म॑ विभेदक रूप स॑ अभिव्यक्त प्रोटीन केरऽ ज्वालामुखी प्लॉट । (जी) रचनात्मकता मार्ग विश्लेषण 8 सप्ताह के रूप म॑ वर्गीकृत Mfn2cKO पीएन म॑ पांच सबसें महत्वपूर्ण अप-रेगुलेशन (लाल) आरू डाउन-रेगुलेशन (नीला) मार्ग क॑ दर्शाबै छै । प्रत्येक पता चलल प्रोटीन के औसत अभिव्यक्ति स्तर देखाओल गेल अछि । ग्रेस्केल हीट मैप: समायोजित पी मान। ns, महत्वपूर्ण नहि।
प्रोटीओमिक्स केरऽ आंकड़ा स॑ पता चललै कि परिसर I, III, आरू IV केरऽ प्रोटीन अभिव्यक्ति धीरे-धीरे कम होय गेलै । परिसर I, III, आरू IV सब म॑ आवश्यक mtDNA-एन्कोडेड सबयूनिट छेलै, जबकि परिसर II, जे केवल न्यूक्लियर-कोडेड छेलै, मूल रूप स॑ अप्रभावित छेलै (चित्र 2A आरू चित्र S2A) । . प्रोटीओमिक्स परिणाम के अनुरूप, सेरिबेलर ऊतक खंड के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री न॑ देखैलकै कि पीएन म॑ कॉम्प्लेक्स IV केरऽ एमटीसीओ१ (माइटोकॉन्ड्रिया साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज सबयूनिट १) सबयूनिट स्तर म॑ धीरे-धीरे कमी आबी गेलै (चित्र २ बी) । mtDNA-एन्कोडेड सबयूनिट Mtatp8 काफी कम होय गेलऽ छेलै (चित्र S2A), जबकि न्यूक्लियर-एन्कोडेड एटीपी सिंथेज सबयूनिट केरऽ स्थिर-स्थिति स्तर अपरिवर्तित रहलऽ, जे ज्ञात स्थिर एटीपी सिंथेज सबएसेम्बली F1 परिसर के अनुरूप छै जब॑ mtDNA अभिव्यक्ति स्थिर होय छै । गठन सुसंगत अछि। व्यवधान (7)। रियल-टाइम पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) द्वारा सॉर्ट करलऽ गेलऽ Mfn2cKO पीएन म॑ mtDNA स्तर के मूल्यांकन स॑ mtDNA कॉपी नंबर म॑ धीरे-धीरे कमी के पुष्टि होय गेलै । नियंत्रण समूह कें तुलना मे, 8 सप्ताह कें उम्र मे, mtDNA स्तर कें केवल लगभग 20% बरकरार राखल गेलय (चित्र 2C)। ई परिणाम के अनुरूप, Mfn2cKO PNs के कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी धुंधलापन के उपयोग डीएनए के पता लगाबै लेली करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा स॑ माइटोकॉन्ड्रिया न्यूक्लियोटाइड (चित्र 2D) के समय-निर्भर खपत दिखालऽ गेलऽ छेलै । हमनें पाया कि माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन अपघटन आरू तनाव प्रतिक्रिया म॑ शामिल केवल कुछ उम्मीदवार अप-रेगुलेटेड छेलै, जेकरा म॑ Lonp1, Afg3l2 आरू Clpx, आरू OXPHOS जटिल असेंबली कारक शामिल छेलै । एपोप्टोसिस म॑ शामिल प्रोटीन केरऽ स्तर म॑ कोनो महत्वपूर्ण परिवर्तन नै देखलऽ गेलै (चित्र S2B) । तहिना, हमनें पाया कि कैल्शियम परिवहन म॑ शामिल माइटोकॉन्ड्रिया आरू एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम चैनलऽ म॑ खाली छोटऽ-छोटऽ बदलाव होय छै (चित्र S2C) । एकरऽ अलावा, ऑटोफेजी स॑ संबंधित प्रोटीन केरऽ मूल्यांकन म॑ कोनो महत्वपूर्ण परिवर्तन नै मिललै, जे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री आरू इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्र S3) द्वारा इन विवो म॑ देखलऽ गेलऽ ऑटोफेगोसोम केरऽ दृश्यमान प्रेरण के अनुरूप छै । लेकिन पीएन म॑ प्रगतिशील ऑक्सफोस विकार के साथ-साथ स्पष्ट अल्ट्रास्ट्रक्चरल माइटोकॉन्ड्रिया परिवर्तन भी होय छै । माइटोकॉन्ड्रिया समूह 5 आरू 8 सप्ताह के उम्र के Mfn2cKO PNs के कोशिका शरीर आरू डेंड्रिटिक वृक्ष म॑ देखलऽ जाब॑ सकै छै, आरू भीतरी झिल्ली संरचना म॑ गहरा बदलाव आबी गेलऽ छै (चित्र S4, A आरू B) । ई अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तन आरू mtDNA म॑ ​​काफी कमी के अनुरूप, टेट्रामिथाइलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (TMRM) के साथ तीव्र सेरेब्रल सेरिबेलर स्लाइस के विश्लेषण स॑ पता चललै कि Mfn2cKO पीएन म॑ माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली के क्षमता म॑ काफी कमी आबी गेलऽ छै (चित्र S4C) ।
(A) OXPHOS परिसर के अभिव्यक्ति स्तर के समय पाठ्यक्रम विश्लेषण | केवल 8 सप्ताह मे P<0.05 वाला प्रोटीन पर विचार करू (दू-तरफा एनोवा)। बिंदीदार रेखा : सीटीआरएल क तुलना मे कोनो समायोजन नहि। (B) बायां : एंटी-एमटीसीओ1 एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) स॑ लेबल करलऽ गेलऽ सेरिबेलर खंड केरऽ उदाहरण । पुर्किन्जे कोशिका शरीर केरऽ कब्जा वाला क्षेत्र पीला रंग स॑ ढकलऽ छै । दाहिना: MTCO1 स्तर केरऽ मात्रा निर्धारण (विचरण केरऽ एकतरफा विश्लेषण; n = तीन चूहों स॑ विश्लेषण करलऽ गेलऽ 7 स॑ 20 कोशिका) । (सी) छंटाई पीएन म॑ mtDNA प्रतिलिपि संख्या के qPCR विश्लेषण (विचरण के एकतरफा विश्लेषण; n = 3 स॑ 7 चूहों) । (D) बामा : एंटी-डीएनए एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 μm) स॑ लेबल करलऽ गेलऽ सेरिबेलर स्लाइस केरऽ उदाहरण । पुर्किन्जे कोशिका शरीर केरऽ कब्जा वाला क्षेत्र पीला रंग स॑ ढकलऽ छै । दाहिना: mtDNA घाव के मात्रा निर्धारण (विचरण के एकतरफा विश्लेषण; तीन चूहों स॑ n = 5 स॑ 9 कोशिका) । (E) एक तीव्र सेरिबेलर अनुभाग का एक उदाहरण जो एक पूरा कोशिका पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग म॑ mitoYFP + Purkinje कोशिका (तीर) क॑ दिखाबै छै । (F) चतुर्थ वक्र के मात्रा निर्धारण। (जी) सीटीआरएल और Mfn2cKO पुर्किन्जे कोशिकाओं में विध्रुवीकरण करंट इंजेक्शन के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग | टॉप ट्रेस : पहिल पल्स जे एपी के ट्रिगर केलक। निचला ट्रेस: ​​अधिकतम एपी आवृत्ति। (H) पोस्टसिनैप्टिक स्वतःस्फूर्त इनपुट (sPSPs) के मात्रा निर्धारण | प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग ट्रेस आरू ओकरऽ जूम अनुपात (I) म॑ दिखालऽ गेलऽ छै । विचरण के एकतरफा विश्लेषण तीन चूहों स॑ n = 5 स॑ 20 कोशिका के विश्लेषण करलकै । डेटा औसत±SEM के रूप मे व्यक्त कयल गेल अछि; * पी <0.05; ** पी <0.01; ***पी <0.001। (J) छिद्रित पैच क्लैंप मोड कें उपयोग सं रिकॉर्ड कैल गेलय सहज एपी कें प्रतिनिधि निशान. शीर्ष ट्रेस: ​​अधिकतम एपी आवृत्ति। निचला ट्रेस: ​​एकल एपी के ज़ूम। (K) (J) के अनुसार औसत एवं अधिकतम एपी आवृत्ति की मात्रा निर्धारित कीजिए | मान-व्हिटनी परीक्षण; n = 5 कोशिकाओ ंको चार चूहों से विश्लेषण ककया गया | डेटा औसत±SEM के रूप मे व्यक्त कयल गेल अछि; महत्वपूर्ण नहि।
8 सप्ताह पुरान Mfn2cKO PN म॑ स्पष्ट OXPHOS क्षति के पता चललै, जे ई दर्शाबै छै कि न्यूरॉन्स केरऽ शारीरिक कार्य गंभीर रूप स॑ असामान्य छै । अतः, हमनें तीव्र सेरिबेलर स्लाइस (चित्र 2E) म॑ पूरा कोशिका पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग करी क॑ 4 स॑ 5 सप्ताह आरू 7 स॑ 8 सप्ताह म॑ OXPHOS-कमी वाला न्यूरॉन्स केरऽ निष्क्रिय विद्युत विशेषता के विश्लेषण करलकै । अप्रत्याशित रूप स॑, Mfn2cKO न्यूरॉन्स केरऽ औसत आराम झिल्ली क्षमता आरू इनपुट प्रतिरोध नियंत्रण के समान छेलै, हालांकि कोशिका के बीच सूक्ष्म अंतर छेलै (तालिका 1) । तहिना 4 सं 5 सप्ताहक उम्र मे करंट-वोल्टेज संबंध (IV वक्र) मे कोनो महत्वपूर्ण परिवर्तन नहि भेटल (चित्र 2F) । लेकिन, 7 स॑ 8 सप्ताह केरऽ कोय भी Mfn2cKO न्यूरॉन्स IV रेजीम (हाइपरपोलराइजेशन स्टेप) स॑ नै बचलै, जे ई दर्शाबै छै कि ई देर स॑ हाइपरपोलराइजेशन संभावना के प्रति स्पष्ट संवेदनशीलता छै । एकरऽ विपरीत, Mfn2cKO न्यूरॉन्स म॑, रिपीटीटिव एक्शन पोटेंशियल (एपी) डिस्चार्ज पैदा करै वाला डिपोलराइजिंग करंट क॑ अच्छा तरह स॑ सहन करलऽ जाय छै, जे ई दर्शाबै छै कि ओकरऽ समग्र डिस्चार्ज पैटर्न 8 सप्ताह पुरानऽ नियंत्रण न्यूरॉन्स स॑ काफी भिन्न नै छै (तालिका 1 आरू चित्र 2G) । तहिना, स्वतःस्फूर्त पोस्टसिनैप्टिक करंट (sPSCs) केरऽ आवृत्ति आरू आयाम नियंत्रण समूह केरऽ तुलना म॑ तुलनीय छेलै, आरू घटना केरऽ आवृत्ति 4 सप्ताह स॑ बढ़ी क॑ 5 सप्ताह स॑ 7 सप्ताह स॑ 8 सप्ताह तलक बढ़ी गेलऽ छेलै जेकरा म॑ भी ऐन्हऽ ही वृद्धि होय गेलऽ छेलै (चित्र 2, एच आरू आई) । पीएन (25) में सिनैप्टिक परिपक्वता की अवधि। छिद्रित पीएनएस पैच के बाद सेहो एहने परिणाम भेटल। इ विन्यास कोशिकीय एटीपी दोषक कें संभावित क्षतिपूर्ति कें रोकय छै, जेना कि पूरा कोशिका पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग मे भ सकय छै. विशेष रूप स॑, Mfn2cKO न्यूरॉन्स केरऽ आराम झिल्ली क्षमता आरू सहज फायरिंग आवृत्ति प्रभावित नै छेलै (चित्र 2, जे आरू के) । संक्षेप म॑ ई परिणाम संकेत करै छै कि स्पष्ट ऑक्सफोस विकार वाला पीएन उच्च आवृत्ति वाला डिस्चार्ज पैटर्न स॑ अच्छा तरह स॑ सामना करी सकै छै, जे ई दर्शाबै छै कि एक मुआवजा तंत्र छै जे ओकरा लगभग सामान्य विद्युत शारीरिक प्रतिक्रिया क॑ बनाए रखै के अनुमति दै छै ।
डेटा औसत ± एसईएम (विचरण के एकतरफा विश्लेषण, होल्म-सिडक के बहु तुलना परीक्षण; * पी <0.05) के रूप मे व्यक्त ककया गया है | इकाई संख्या कोष्ठक सं दर्शाओल गेल अछि.
हमनें ई जांच करै लेली निकललै कि की प्रोटीओमिक्स डाटासेट (चित्र 1G) म॑ कोनो भी श्रेणी म॑ ऐन्हऽ मार्ग शामिल छै जे गंभीर ऑक्सफोस कमी के मुकाबला करी सकै छै, जेकरा स॑ ई समझैलऽ जाय सकै छै कि प्रभावित पीएन लगभग सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (चित्र 2, ई स॑ के) क॑ की वजह स॑ कायम रखै सकै छै । . प्रोटीओमिक्स विश्लेषण स॑ पता चललै कि शाखाबद्ध श्रृंखला अमीनो एसिड (BCAA) केरऽ कैटाबोलिज्म म॑ शामिल एंजाइम काफी अप-रेगुलेटेड छेलै (चित्र 3A आरू चित्र S5A), आरू अंतिम उत्पाद एसिटाइल-कोए (CoA) या सुक्सिनिल CoA धमनीकाठिन्य एसिड (TCA) चक्र म॑ ट्राइकार्बोक्जिलेट के पूरक होय सकै छै । हमरा सब के पता चललै कि बीसीएए ट्रांसएमिनेज़ १ (बीसीएटी१) आरू बीसीएटी२ दोनों के सामग्री बढ़ी गेलै । वे α-कीटोग्लूटारेट ( 26 ) स॑ ग्लूटामेट पैदा करी क॑ बीसीएए कैटाबोलिज्म केरऽ पहलऽ चरण क॑ उत्प्रेरक बनाबै छै । शाखाबद्ध श्रृंखला कीटो एसिड डिहाइड्रोजनेज (BCKD) परिसर बनाबै वाला सब उप-इकाई अपरेगुलेट होय जाय छै (संकुल परिणामस्वरूप बीसीएए कार्बन कंकाल के बाद के आरू अपरिवर्तनीय डिकार्बोक्जिलेशन के उत्प्रेरक होय छै) (चित्र 3A आरू चित्र S5A) । लेकिन, छंटनी करलऽ गेलऽ पीएन म॑ खुद बीसीएए म॑ कोनो स्पष्ट परिवर्तन नै मिललै, जेकरऽ कारण ई आवश्यक अमीनो एसिड केरऽ बढ़लऽ कोशिकीय अवशोषण या टीसीए चक्र के पूरक के रूप म॑ अन्य स्रोत (ग्लूकोज या लैक्टिक एसिड) के उपयोग होय सकै छै (चित्र S5B) । ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन म॑ भी 8 सप्ताह के उम्र म॑ ग्लूटामाइन अपघटन आरू ट्रांसएमिनेसन गतिविधि म॑ वृद्धि देखलऽ गेलै, जेकरा माइटोकॉन्ड्रिया एंजाइम ग्लूटामिनेज (जीएलएस) आरू ग्लूटामाइन पाइरुवेट ट्रांसएमिनेज़ 2 (जीपीटी2) के अप-रेगुलेशन स॑ परिलक्षित होय सकै छै (चित्र 3, ए आरू सी) । ध्यान देबऽ के बात छै कि जीएलएस केरऽ अप-रेगुलेशन स्प्लिस्ड आइसोफॉर्म ग्लूटामिनेज सी (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL केरऽ परिवर्तन लगभग 4.5-गुना, P = 0.05) तलक सीमित छै, आरू कैंसर के ऊतकऽ म॑ एकरऽ विशिष्ट अप-रेगुलेशन माइटोकॉन्ड्रिया जैव ऊर्जा के समर्थन करी सकै छै । (27) के।
(A) हीट मैप मे 8 सप्ताह मे निर्दिष्ट मार्ग कें लेल प्रोटीन स्तर मे गुना परिवर्तन कें दर्शाओल गेल छै. (B) एंटी-पीसीएक्स एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) के साथ लेबल एक सेरिबेलर स्लाइस का उदाहरण | पीला तीर पुर्किन्जे कोशिका शरीर दिस इशारा करैत अछि । (C) समय पाठ्यक्रम प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण धमनीकाठिन्य (बहु टी-परीक्षण, * FDR <5%; n = 3-5 चूहों) के लिए एक महत्वपूर्ण उम्मीदवार के रूप में पहचाना गया | (D) ऊपर : एकटा योजनाबद्ध आरेख जे [1-13C]पाइरुवेट ट्रेसर (अर्थात, पीडीएच या ट्रांस-आर्टेरियल मार्ग के माध्यम स॑) म॑ निहित लेबल कार्बन म॑ प्रवेश के अलग-अलग तरीका दर्शाबै छै । नीचे: वायलिन चार्ट म॑ तीव्र सेरिबेलर स्लाइस क॑ [1-13C]पाइरुवेट (युग्मित टी-परीक्षण; ** P <0.01) स॑ लेबल करला के बाद एस्पार्टिक एसिड, साइट्रिक एसिड आरू मैलिक एसिड म॑ बदललऽ गेलऽ एकल-लेबल कार्बन (M1) केरऽ प्रतिशत दिखालऽ गेलऽ छै । (ङ) संकेतित मार्ग का व्यापक समय इतिहास विश्लेषण | केवल 8 सप्ताह मे P<0.05 वाला प्रोटीन पर विचार करू . डैश रेखा: कोनो समायोजन मान (विचरण के द्वि-तरफा विश्लेषण; * पी <0.05; *** पी <0.001)। डेटा औसत±SEM के रूप मे व्यक्त कयल गेल अछि |
हमरऽ विश्लेषण म॑ बीसीएए कैटाबोलिज्म प्रमुख अप-रेगुलेशन मार्गऽ म॑ स॑ एक बनी गेलऽ छै । ई तथ्य स॑ ई बात के मजबूती स॑ संकेत मिलै छै कि ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन म॑ टीसीए चक्र म॑ प्रवेश करै वाला वेंटिलेशन केरऽ मात्रा म॑ बदलाव आबी सकै छै । ई न्यूरॉनल मेटाबोलिक रिवाइरिंग केरऽ एगो प्रमुख रूप के प्रतिनिधित्व करी सकै छै, जेकरऽ सीधा प्रभाव न्यूरॉनल फिजियोलॉजी आरू गंभीर ऑक्सफोस विकार केरऽ रखरखाव के दौरान जीवित रहना प॑ पड़॑ सकै छै । ई परिकल्पना के अनुरूप, हमनें पाया कि मुख्य एंटी-एथेरोस्क्लेरोटिक एंजाइम PCx अप-रेगुलेटेड छै (Mfn2cKO/CTRL लगभग 1.5 गुना बदलै छै; चित्र 3A), जे पाइरुवेट के ऑक्सालोएसीटेट (28) म॑ बदलै के उत्प्रेरक छै, जे मस्तिष्क के ऊतक म॑ मानलऽ जाय छै The expression in is restricted to astrocytes (29, 30). प्रोटीओमिक्स परिणाम के अनुरूप, कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी न॑ देखैलकै कि पीसीएक्स अभिव्यक्ति ऑक्सफोस-कमी वाला पीएन म॑ विशेष रूप स॑ आरू काफी बढ़ी गेलऽ छेलै, जबकि पीसीएक्स प्रतिक्रियाशीलता मुख्य रूप स॑ नियंत्रण केरऽ समीपस्थ बर्गमैन ग्लिया कोशिका तलक सीमित छेलै (चित्र 3 बी) । पीसीएक्स केरऽ देखलऽ गेलऽ अपरेग्यूलेशन क॑ कार्यात्मक रूप स॑ परीक्षण करै लेली, हमन॑ [1-13C] पाइरुवेट ट्रेसर स॑ तीव्र सेरिबेलर स्लाइस क॑ इलाज करलकै । जब॑ पाइरुवेट क॑ पाइरुवेट डिहाइड्रोजनेज (PDH) द्वारा ऑक्सीकरण करलऽ गेलऽ छेलै, त॑ ओकरऽ आइसोटोप लेबल गायब होय गेलै , लेकिन जब॑ पाइरुवेट क॑ संवहनी प्रतिक्रिया द्वारा चयापचय करलऽ जाय छै त॑ टीसीए चक्र मध्यवर्ती म॑ शामिल होय जाय छै (चित्र 3D) । अपनऽ प्रोटीओमिक्स डाटा के समर्थन म॑, हमन॑ Mfn2cKO स्लाइस केरऽ एस्पार्टिक एसिड म॑ ई ट्रेसर स॑ बहुत संख्या म॑ मार्कर देखलकै, जबकि साइट्रिक एसिड आरू मैलिक एसिड म॑ भी मध्यम प्रवृत्ति छेलै, हालांकि महत्वपूर्ण नै छेलै (चित्र 3D) ।
माइटोपार्क चूहों के डोपामाइन न्यूरॉन्स म॑ माइटोकॉन्ड्रिया विकार के कारण डोपामाइन न्यूरॉन्स न॑ विशेष रूप स॑ माइटोकॉन्ड्रिया ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए जीन (Tfam) (चित्र S6B) क॑ नष्ट करी क॑, पीसीएक्स अभिव्यक्ति भी काफी अप-रेगुलेट करलऽ गेलऽ छेलै (31), जे ई दर्शाबै छै कि एसीटोन एसिड धमनीकाठिन्य न्यूरॉनल केरऽ विकार के दौरान बीमारी केरऽ घटना विनियमित होय छै शरीर में ऑक्सफोस। ध्यान देबऽ के बात छै कि ई पाबै गेलऽ छै कि अद्वितीय एंजाइम (32-34) जे न्यूरॉन्स म॑ व्यक्त होय सकै छै जे धमनीकाठिन्य स॑ जुड़लऽ होय सकै छै, ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन म॑ काफी अप-रेगुलेट होय जाय छै, जेना कि प्रोपिओनाइल-कोए कार्बोक्जिलेज (पीसीसी-ए), मैलोनिल-कोए प्रोपिओनाइल-कोए क॑ सुक्सिनिल-कोए आरू माइटोकॉन्ड्रिया मैलिक 3 (ME3), एंजाइम म॑ बदलै छै । जेकरऽ मुख्य भूमिका मैलेट स॑ पाइरुवेट क॑ बरामद करना छै (चित्र 3, ए आरू सी) (33, 35) । एकरऽ अलावा, हमन॑ Pdk3 एंजाइम म॑ काफी वृद्धि पाबै छै, जे फॉस्फोरिलेशन करै छै आरू ई तरह पीडीएच क॑ निष्क्रिय करै छै (36), जबकि पीडीएच या खुद पीडीएच एंजाइम परिसर क॑ सक्रिय करै वाला Pdp1 एंजाइम म॑ कोनो बदलाव के पता नै चललै (चित्र 3 ए) । लगातार, Mern2cKO पीएन म॑, Ser293 (पीडीएच केरऽ एंजाइम गतिविधि क॑ रोकै लेली जानलऽ जाय छै) म॑ पीडीएच परिसर केरऽ पाइरुवेट डिहाइड्रोजनेज ई 1 घटक केरऽ α1 सबयूनिट α (PDHE1α) सबयूनिट केरऽ फॉस्फोरिलेशन बढ़ी गेलऽ छेलै (चित्र S6C) (चित्र S6C) । पाइरुवेट कें कोनों संवहनी पहुंच नहि होयत छै.
अंततः, हमनें पाया कि सेरीन आरू ग्लाइसिन जैव संश्लेषण के सुपर मार्ग, संबंधित माइटोकॉन्ड्रिया फोलेट (1C) चक्र आरू प्रोलाइन जैव संश्लेषण (चित्र 1G आरू चित्र S5C) सब सक्रियण प्रक्रिया के दौरान, रिपोर्ट के अनुसार, काफी अप-रेगुलेटेड छै. आसपास के ऊतक माइटोकॉन्ड्रिया के विकार ( 5-7 ) के साथ सक्रिय होय जाय छै । ई प्रोटीओमिक्स डाटा के समर्थन करै वाला कॉनफोकल विश्लेषण स॑ पता चललै कि ऑक्सफोस गायब होय वाला पीएन म॑ 8 सप्ताह के चूहा के सेरिबेलर स्लाइस क॑ माइटोकॉन्ड्रिया फोलेट चक्र केरऽ एगो प्रमुख एंजाइम सेरीन हाइड्रोक्सीमिथाइलट्रांसफरेज़ 2 (SHMT2) के अधीन करलऽ गेलऽ छेलै । महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (चित्र S5D)। 13 सीयू-ग्लूकोज-इन्क्यूबेट तीव्र सेरिबेलर स्लाइस म॑, मेटाबोलिक ट्रेसिंग प्रयोग न॑ सेरीन आरू प्रोलाइन जैव संश्लेषण केरऽ अप-रेगुलेशन केरऽ आरू पुष्टि करलकै, जे ई दर्शाबै छै कि सेरीन आरू प्रोलाइन म॑ कार्बन आइसोफॉर्म केरऽ प्रवाह बढ़ी गेलै (चित्र S5E) । चूँकि GLS आरू GPT2 द्वारा बढ़ावा देलऽ गेलऽ प्रतिक्रिया ग्लूटामाइन स॑ ग्लूटामेट के संश्लेषण आरू ग्लूटामेट आरू α-कीटोग्लूटारेट के बीच ट्रांसएमिनेशन लेली जिम्मेदार छै, एकरऽ अपरेग्यूलेशन संकेत करै छै कि OXPHOS-कमी वाला न्यूरॉन्स म॑ ग्लूटामेट केरऽ मांग बढ़ी गेलऽ छै , एकरऽ उद्देश्य प्रोलाइन केरऽ बढ़लऽ जैव संश्लेषण क॑ बनाए रखना हो सकै छै (चित्र S5C) । ई परिवर्तनऽ के विपरीत, पीएन-विशिष्ट Mfn2cKO चूहऽ स॑ सेरिबेलर एस्ट्रोसाइट्स केरऽ प्रोटीओमिक विश्लेषण स॑ पता चललै कि ई मार्ग (सब एंटीपेरोक्साइडेज सहित) अभिव्यक्ति म॑ महत्वपूर्ण बदलाव नै ऐलै, जेकरा स॑ ई दर्शायलऽ गेलऽ छै कि ई चयापचय पुनर्निर्देशन अपघटित पीएन (चित्र S6, डी स॑ जी) लेली चयनात्मक छै ।
संक्षेप म॑, ई विश्लेषणऽ स॑ पीएन म॑ विशिष्ट चयापचय मार्ग केरऽ टेम्पोरल सक्रियण केरऽ काफी अलग पैटर्न के पता चललै । यद्यपि असामान्य न्यूरॉनल माइटोकॉन्ड्रिया कार्य प्रारंभिक धमनीकाठिन्य आरू 1C रिमोडलिंग (चित्र 3E आरू चित्र S5C) के कारण बनी सकै छै, आरू यहां तक ​​कि I आरू IV परिसरऽ के अभिव्यक्ति म॑ पूर्वानुमानित परिवर्तन भी, सेरीन डी नोवो संश्लेषण म॑ बदलाव केवल ई केवल देर स॑ ही स्पष्ट होय गेलै । OXPHOS विकार (चित्र 3E आ चित्र S5C)। ई निष्कर्ष एकटा क्रमिक प्रक्रिया क॑ परिभाषित करै छै जेकरा म॑ तनाव-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रिया (1C चक्र) आरू साइटोप्लाज्मिक (सेरिन जैव संश्लेषण) टीसीए चक्र म॑ धमनीकाठिन्य म॑ वृद्धि के साथ समन्वयात्मक रूप स॑ प्रतिक्रिया दै छै ताकि न्यूरॉनल चयापचय क॑ नया रूप दै छै ।
8 सप्ताह कें ऑक्सफोस कें कमी वाला पीएन उच्च आवृत्ति उत्तेजना गतिविधि कें बनाए रख सकय छै आ माइटोकॉन्ड्रिया विकार कें भरपाई कें लेल महत्वपूर्ण चयापचय पुनर्संयोजन सं गुजर सकय छै. ई खोज एगो रोचक संभावना पैदा करै छै कि ई क्षण म॑ भी ई कोशिका न्यूरोडिजनरेशन म॑ देरी या रोकथाम लेली चिकित्सीय हस्तक्षेप भी प्राप्त करी सकै छै । देरी। हम दूटा स्वतंत्र हस्तक्षेप क माध्यम स एहि संभावना क समाधान केलहुं। पहिलऽ विधि म॑, हमन॑ एक Cre-निर्भर एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (AAV) वेक्टर डिजाइन करलकै ताकि MFN2 क॑ चुनिंदा रूप स॑ विवो म॑ OXPHOS-कमी वाला पीएन म॑ व्यक्त करलऽ जाय सक॑ (चित्र S7A) । MFN2 आरू फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन mCherry (Mfn2-AAV) क॑ एन्कोडिंग करै वाला एएवी क॑ इन विट्रो म॑ प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति म॑ सत्यापन करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा स॑ MFN2 क॑ Cre-निर्भर तरीका स॑ व्यक्त करलऽ गेलऽ छेलै आरू माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान क॑ बचाबै के काम करलकै, जेकरा स॑ Mfn2cKO न्यूरॉन्स म॑ न्यूरोम्यूटेशन क॑ रोकलऽ गेलै (चित्र S7, B, D आरू E) । अगिला, हमनें Mfn2cKO आरू नियंत्रण चूहों के सेरिबेलर कॉर्टेक्स म॑ 8 सप्ताह के Mfn2-AAV क॑ स्टीरियोटैक्टिक रूप स॑ वितरित करै लेली इन विवो प्रयोग करलकै, आरू 12 सप्ताह के चूहों के विश्लेषण करलकै (चित्र 4 ए) । उपचारित Mfn2cKO चूहों मरी गेलै (चित्र 1, ए आरू बी) (16)। इन विवो म॑ वायरल ट्रांसडक्शन के परिणामस्वरूप कुछ सेरिबेलर सर्कल (चित्र S7, G आरू H) म॑ पीएन केरऽ चयनात्मक अभिव्यक्ति होय गेलऽ छेलै । केवल mCherry (Ctrl-AAV) क॑ व्यक्त करै वाला नियंत्रण एएवी केरऽ इंजेक्शन स॑ Mfn2cKO जानवरऽ म॑ न्यूरोडिजनरेशन केरऽ डिग्री प॑ कोनों महत्वपूर्ण प्रभाव नै पड़लै । एकरऽ विपरीत, Mfn2-AAV स॑ ट्रांसड्यूस करलऽ गेलऽ Mfn2cKOs के विश्लेषण न॑ पीएन कोशिका परत (चित्र 4, बी आरू सी) केरऽ एगो महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रभाव देखैलकै । विशेष रूप स॑ न्यूरॉन घनत्व नियंत्रण जानवरऽ स॑ लगभग अभेद्य प्रतीत होय छै (चित्र ४, बी आरू सी, आरू चित्र एस७, एच आरू आई) । MFN1 केरऽ अभिव्यक्ति लेकिन MFN2 केरऽ नै, न्यूरॉनल मृत्यु क॑ बचाबै म॑ समान रूप स॑ प्रभावी छै (चित्र 4C आरू चित्र S7, C आरू F), जे संकेत करै छै कि एक्टोपिक MFN1 केरऽ अभिव्यक्ति प्रभावी ढंग स॑ MFN2 केरऽ कमी के पूरक होय सकै छै । एकल पीएन स्तर प॑ आगू के विश्लेषण स॑ पता चललै कि Mfn2-AAV न॑ काफी हद तलक माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ अल्ट्रास्ट्रक्चर क॑ बचाय लेलकै, mtDNA स्तर क॑ सामान्य करी देलकै, आरू एंटी-एंजियोजेनेसिस मार्कर पीसीएक्स (चित्र 4, सी स॑ ई) केरऽ उच्च अभिव्यक्ति क॑ उलट देलकै । आराम केरऽ अवस्था म॑ बचालऽ गेलऽ Mfn2cKO चूहऽ के दृश्य निरीक्षण स॑ पता चललै कि ओकरऽ मुद्रा आरू मोटर लक्षण (मूवमेंट S1 स॑ S3) म॑ सुधार होय गेलऽ छै । निष्कर्षतः ई प्रयोगऽ स॑ पता चलै छै कि ऑक्सफोस म॑ गंभीर कमी वाला पीएन म॑ एमएफएन२ केरऽ देरी स॑ पुनः प्रवेश mtDNA के खपत क॑ उलटै लेली आरू धमनीकाठिन्य पैदा करै लेली पर्याप्त छै, जेकरा स॑ इन विवो म॑ एक्सोन क्षय आरू न्यूरॉनल मौत क॑ रोकै छै ।
(A) एकटा योजना जे MFN2 कें एन्कोडिंग करय वाला एएवी कें इंजेक्शन कें लेल प्रयोगात्मक अनुसूची कें दर्शा रहल छै जखन संकेतित चयापचय मार्ग सक्रिय भ जायत छै. (B) Mfn2cKO चूहों म॑ 8 सप्ताह म॑ ट्रांसड्यूस करलऽ गेलऽ आरू एंटी-कैलबिंडिन एंटीबॉडी स॑ लेबल करलऽ गेलऽ 12 सप्ताह केरऽ सेरिबेलर स्लाइस केरऽ प्रतिनिधि कॉनफोकल छवि । दाहिना : अक्षतंतु रेशा के स्केलिंग। अक्षतंतु जूम केरऽ पैमाना ४५० आरू ७५ माइक्रोन छै । (C) बाएं: एएवी संप्रेषण लूप (एएवी +) (विचरण के एकतरफा विश्लेषण; n = 3 चूहों) म॑ पुर्किन्जे कोशिका घनत्व केरऽ मात्रा निर्धारण । दाहिना: सप्ताह 12 (अनपेयर टी-टेस्ट; तीन चूहों स॑ n = 6 कोशिका) म॑ ट्रांसड्यूस्ड पीएन म॑ mtDNA फोकस विश्लेषण । * पी <0.05; ** पी <0.01। (D) संकेतित वायरल वैक्टर के साथ ट्रांसड्यूस Mfn2cKO सेरिबेलर अनुभागों के पीएन के प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ | गुलाबी रंगक मुखौटा डेंड्राइट्स द्वारा कब्जा कयल गेल क्षेत्रक चित्रण करैत अछि, आ पीयर बिंदीदार वर्ग दाहिना दिस देल गेल जूमक चित्रण करैत अछि ; n नाभिक के प्रतिनिधित्व करता है। पैमाने पर बार, 1μm। (ई) 12 सप्ताह मे ट्रांसड्यूस्ड पीएन मे पीसीएक्स धुंधलापन कें एकटा उदाहरण दर्शा रहल छै. पैमाने पर बार, 20μm। ओई, अतिअभिव्यक्ति; एफसी, गुना परिवर्तन।
अंततः, हमनें पीएन म॑ पेरोक्साइडेज-प्रेरित कोशिका जीवित रहना के महत्व के जांच करलकै जेकरा म॑ ऑक्सफोस विकार के अनुभव होय गेलऽ छै । हमनें विशेष रूप स॑ माउस PCx mRNA (AAV-shPCx) क॑ लक्षित करी क॑ एएवी-shRNA (छोटऽ हेयरपिन आरएनए) क॑ एन्कोडिंग करै वाला mCherry पैदा करलकै, आरू Mfn2cKO चूहऽ के सेरिबैलम म॑ वायरस या ओकरऽ स्क्रैम्बल नियंत्रण (AAV-scr) क॑ इंजेक्ट करलकै । इंजेक्शन उम्र के चारिम सप्ताह (चित्र 5 ए) म॑ करलऽ गेलऽ छेलै ताकि वू अवधि म॑ प्रभावी पीसीएक्स नॉक डाउन प्राप्त करलऽ जाय सक॑ जब॑ पीसीएक्स अभिव्यक्ति बढ़ी गेलऽ छेलै (चित्र 3 सी) आरू पीएन कोशिका परत अभी भी बरकरार छेलै (चित्र 1 ए) । ध्यान देबऽ के बात छै कि पीसीएक्स (चित्र S8A) क॑ गिरैला स॑ पीएन मौत म॑ काफी तेजी आबै छै, जे संक्रमित रिंग (चित्र 5, बी आरू सी) तलक सीमित छै । पीसीएक्स अप-रेगुलेशन द्वारा प्रेरित चयापचय प्रभाव के तंत्र क॑ समझै के क्रम म॑, हमन॑ पीसीएक्स नॉक डाउन के बाद पीएन केरऽ रेडॉक्स स्थिति के अध्ययन करलकै आरू एएवी-मध्यस्थता ऑप्टिकल बायोसेंसर Grx1-roGFP2 क॑ एक साथ व्यक्त करलऽ गेलऽ छेलै (चित्र S8, बी स॑ डी) ग्लूटाथियोन के मूल्यांकन करै लेली पेप्टाइड रेडॉक्स क्षमता (38) के सापेक्षिक परिवर्तन । तखन, हम 7 सप्ताह पुरान Mfn2cKO या नियंत्रण littermates के तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में दू-फोटॉन प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) प्रदर्शन FLIM स्थिति (चित्र S8, E to G) के सत्यापन के बाद साइटोप्लाज्मिक रेडॉक्स स्थिति में संभावित परिवर्तन के पता लगाबय लेल. विश्लेषण न॑ एकल Mfn2cKO PNs केरऽ ऑक्सीकरण अवस्था म॑ काफी वृद्धि देखैलकै जेकरा म॑ PCx अभिव्यक्ति के कमी छै, जे नियंत्रण न्यूरॉन्स या Mfn2cKO PNs स॑ अलग छै जे केवल स्क्रैम्बल shRNA (चित्र 5, डी आरू ई) क॑ व्यक्त करै छै । जब॑ पीसीएक्स अभिव्यक्ति क॑ डाउन-रेगुलेट करलऽ गेलऽ छेलै, त॑ उच्च ऑक्सीकरण अवस्था दिखाबै वाला Mfn2cKO पीएन केरऽ प्रतिशत तीन गुना स॑ भी अधिक बढ़ी गेलऽ छेलै (चित्र 5E), जे ई दर्शाबै छै कि पीसीएक्स अप-रेगुलेशन न॑ पतित न्यूरॉन्स केरऽ रेडॉक्स क्षमता क॑ बरकरार रखलकै ।
(A) एकटा योजना जे shPCx कें एन्कोडिंग करय वाला एएवी कें इंजेक्शन कें लेल प्रयोगात्मक अनुसूची कें दर्शा रहल छै जखन संकेतित चयापचय मार्ग सक्रिय भ जायत छै. (B) 4 सप्ताह मे एंटी-कैल्सीन्यूरिन एंटीबॉडी सं ट्रांसड्यूस आ लेबल कैल गेल Mfn2cKO चूहों मे 8 सप्ताह कें सेरिबेलर खंडक कें प्रतिनिधि कॉनफोकल फोटोग्राफ. पैमाने पर बार, 450μm। (सी) एएवी-ट्रांसड्यूस्ड लूप (विचरण के एकतरफा विश्लेषण; n = 3 से 4 चूहों) में पुर्किन्जे कोशिका घनत्व की मात्रा निर्धारण | डेटा औसत±SEM के रूप मे व्यक्त कयल गेल अछि; ***पी <0.001। (D) प्रतिनिधि FLIM चित्र निर्दिष्ट प्रयोगात्मक परिस्थितियों के तहत ग्लूटाथियोन रेडॉक्स सेंसर Grx1-roGFP2 व्यक्त करय वाला 7 सप्ताह के पीएन के औसत जीवन काल दर्शाता छै. एलयूटी (लुक-अप तालिका) अनुपात: जीवित रहबाक समय अंतराल (पिकोसेकंड मे)। पैमाने पर बार, 25μm। (ई) हिस्टोग्राम (D) (n=158 स॑ 368 कोशिका स॑ ल॑ क॑ हर शर्त के तहत दू चूहों म॑) स॑ Grx1-roGFP2 जीवनकाल मान के वितरण क॑ दर्शाबै छै । प्रत्येक हिस्टोग्राम कें ऊपर पाई चार्ट: काफी लम्बा (लाल, ऑक्सीकरण) या छोट (नीला, कम) जीवन काल मान वाला कोशिका कें संख्या कें दर्शा रहल छै, जे सीटीआरएल-एएवी-एससीआर मे औसत जीवन काल मान कें 1 एसडी सं बेसि छै. (F) प्रस्तावित मॉडल न्यूरॉनल पीसीएक्स के अपरेग्यूलेशन के सुरक्षात्मक प्रभाव क॑ दर्शाबै छै ।
सब मिला क॑, हम्मं॑ यहाँ उपलब्ध कराय देलऽ गेलऽ आंकड़ा बताबै छै कि MFN2 केरऽ पुनः अभिव्यक्ति गंभीर OXPHOS के कमी, गंभीर mtDNA के कमी, आरू अत्यंत असामान्य ista जैसनऽ आकृति विज्ञान के साथ उन्नत पीएन क॑ पूरा तरह स॑ बचाबै सकै छै, जेकरा स॑ उन्नत बीमारी म॑ भी लगातार प्रगति उपलब्ध होय सकै छै । न्यूरोडिजनरेशन कोशिका केरऽ मृत्यु स॑ पहलऽ के चरण केरऽ रिवर्सिबल सबूत प्रदान करै छै । चयापचय लचीलापन केरऽ ई डिग्री प॑ न्यूरॉन्स केरऽ धमनीकाठिन्य (टीसीए चक्र केरऽ एक रिवायरिंग) क॑ प्रेरित करै के क्षमता स॑ आरू जोर देलऽ जाय छै, जे ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन म॑ पीसीएक्स अभिव्यक्ति क॑ रोकै छै आरू कोशिका केरऽ मृत्यु क॑ बढ़ाबै छै, जेकरा स॑ सुरक्षात्मक भूमिका निभाबै छै (चित्र ५एफ) ।
ई अध्ययन म॑ हमन॑ ई सबूत उपलब्ध कराय देलकै कि ऑक्सफोस विकार के प्रति पीएन केरऽ प्रतिक्रिया चयापचय कार्यक्रम द्वारा सक्रिय विभेदक सक्रियण मार्ग के माध्यम स॑ धीरे-धीरे टीसीए चक्र धमनीकाठिन्य म॑ अभिसरण करना छै । हमनें प्रोटीओमिक विश्लेषण केरऽ पुष्टि बहुत पूरक विधि स॑ करलकै आरू पता चललै कि जब॑ गंभीर माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार स॑ चुनौती देलऽ जाय छै, त॑ न्यूरॉन्स म॑ चयापचय लोच केरऽ एगो पहिने स॑ अज्ञात रूप होय छै । हमरा सब क॑ आश्चर्य के बात छै कि पूरा रिवाइरिंग प्रक्रिया जरूरी नै छै कि ई टर्मिनल मेटाबोलिक स्टेट क॑ चिह्नित करै छै जे न्यूरोडिजनरेशन के साथ धीरे-धीरे आरू अपरिवर्तनीय रूप स॑ होय छै, लेकिन हमरऽ डाटा स॑ पता चलै छै कि ई कोशिका केरऽ मृत्यु स॑ पहल॑ के चरण म॑ भी एगो रखरखाव न्यूरॉन के गठन करी सकै छै कार्यात्मक मुआवजा तंत्र । ई खोज संकेत करै छै कि न्यूरॉन्स के शरीर म॑ काफी हद तक मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी होय छै । ई तथ्य साबित करै छै कि बाद म॑ एमएफएन२ केरऽ पुनः परिचय प्रमुख चयापचय मार्करऽ के अभिव्यक्ति क॑ उलट॑ सकै छै आरू पीएन क्षय क॑ रोकी सकै छै । एकरऽ विपरीत ई धमनीकाठिन्य क॑ रोकै छै आरू नस क॑ तेज करै छै । ट्रांससेक्सुअल।
हमरऽ शोध म॑ एगो सबसें आकर्षक निष्कर्ष ई छै कि ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन एंजाइम क॑ अप-रेगुलेट करी क॑ टीसीए चक्र चयापचय क॑ संशोधित करी सकै छै जे विशेष रूप स॑ धमनीकाठिन्य क॑ उत्तेजित करै छै । चयापचय पुनर्व्यवस्था कैंसर कोशिका केरऽ एगो आम विशेषता छै, जेकरा म॑ स॑ कुछ कम करय वाला समकक्ष पैदा करै लेली टीसीए चक्र मध्यवर्ती के पूरक के रूप म॑ ग्लूटामाइन प॑ निर्भर छै, जे श्वसन श्रृंखला क॑ चलाबै छै आरू लिपिड आरू न्यूक्लियोटाइड जैव संश्लेषण पूर्ववर्ती के उत्पादन क॑ बनाए रखै छै (39 , 40) । एक ताजा अध्ययन स॑ पता चललै कि ऑक्सफोस विकार के अनुभव करै वाला परिधीय ऊतकऽ म॑ ग्लूटामाइन/ग्लूटामेट चयापचय केरऽ पुनः जुड़ाव भी एगो प्रमुख विशेषता छै ( 5 , 41 ), जहाँ टीसीए चक्र म॑ ग्लूटामाइन केरऽ प्रवेश के दिशा ऑक्सफोस चोट केरऽ गंभीरता के कारण ( 41 ) प॑ निर्भर करै छै । ). लेकिन, शरीर में न्यूरॉनल मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी के कोनो समानता आ रोग के संदर्भ में एकर संभावित प्रासंगिकता पर स्पष्ट प्रमाण के कमी छै. एक हाल के इन विट्रो अध्ययन म॑, प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स क॑ न्यूरोट्रांसमिशन लेली ग्लूटामेट पूल क॑ जुटाबै के काम करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा स॑ मेटाबोलिक तनाव केरऽ स्थिति म॑ ऑक्सीडेटिव मेटाबॉलिज्म आरू एथेरोस्क्लेरोसिस क॑ बढ़ावा मिलै छै ( 42 ). ध्यान देबऽ के बात छै कि टीसीए चक्र एंजाइम सुसिनेट डिहाइड्रोजनेज केरऽ औषधीय निरोध के तहत, पाइरुवेट कार्बोक्जिलेशन संवर्धित सेरिबेलर दाना न्यूरॉन्स म॑ ऑक्सालोएसिटेट के संश्लेषण क॑ बनाए रखै के मानलऽ जाय छै ( 34 ). लेकिन, मस्तिष्क के ऊतक (जहाँ धमनीकाठिन्य मुख्य रूप स॑ एस्ट्रोसाइट्स तक सीमित मानलऽ जाय छै) के प्रति ई तंत्रऽ के शारीरिक प्रासंगिकता के अखनी भी महत्वपूर्ण शारीरिक महत्व छै ( 43 ). ऐन्हऽ मामला म॑ हमरऽ आंकड़ा बताबै छै कि शरीर म॑ ऑक्सफोस द्वारा क्षतिग्रस्त पीएन क॑ बीसीएए अपघटन आरू पाइरुवेट कार्बोक्जिलेशन म॑ बदललऽ जाब॑ सकै छै, जे टीसीए पूल इंटरमीडिएट केरऽ पूरक के दू मुख्य स्रोत छै । यद्यपि न्यूरॉनल ऊर्जा चयापचय म॑ बीसीएए कैटाबोलिज्म केरऽ कथित योगदान प्रस्तावित करलऽ गेलऽ छै, लेकिन न्यूरोट्रांसमिशन ( 44 ) लेली ग्लूटामेट आरू जीएबीए केरऽ भूमिका के अलावा, अभी भी इन विवो म॑ ई तंत्र केरऽ कोय सबूत नै छै । अतः ई अनुमान लगाना आसान छै कि बेकाम पीएन धमनीकाठिन्य बढ़ा क॑ आत्मसात प्रक्रिया द्वारा संचालित टीसीए मध्यवर्ती पदार्थ के खपत के भरपाई स्वचालित रूप स॑ करी सकै छै । विशेष रूप स॑, एस्पार्टिक एसिड केरऽ बढ़लऽ मांग क॑ बनाए रखै लेली पीसीएक्स केरऽ अपरेग्यूलेशन केरऽ आवश्यकता होय सकै छै, जे माइटोकॉन्ड्रिया विकार ( 45 ) के साथ प्रसारित कोशिका म॑ सुझावलऽ जाय छै । लेकिन, हमरऽ मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण न॑ Mfn2cKO PNs (चित्र S6A) म॑ एस्पार्टिक एसिड केरऽ स्थिर-स्थिति स्तर म॑ कोनो महत्वपूर्ण परिवर्तन के खुलासा नै करलकै, जे संभवतः प्रसारित कोशिका आरू पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स के बीच एस्पार्टिक एसिड केरऽ अलग-अलग चयापचय उपयोग क॑ दर्शाबै छै । हालांकि इन विवो म॑ बेकाम न्यूरॉन्स म॑ पीसीएक्स अपरेग्यूलेशन केरऽ सटीक तंत्र के विशेषता अभी बाकी छै, लेकिन हमन॑ ई सिद्ध करलकै कि ई समय स॑ पहल॑ ई प्रतिक्रिया न्यूरॉन्स केरऽ रेडॉक्स अवस्था क॑ बनाए रखै म॑ महत्वपूर्ण भूमिका निभाबै छै, जेकरऽ प्रदर्शन सेरिबेलर स्लाइस प॑ एफएलआईएम प्रयोग म॑ करलऽ गेलऽ छेलै । विशेष रूप सं, पीएन कें पीसीएक्स कें अप-रेगुलेट करय सं रोकय सं बेसि ऑक्सीकरण अवस्था पैदा भ सकय छै आ कोशिका कें मृत्यु मे तेजी आबि सकय छै. बीसीएए अपघटन के सक्रियण आरू पाइरुवेट के कार्बोक्जिलेशन माइटोकॉन्ड्रिया विकार के परिधीय ऊतक के विशेषता के तरीका नै छै (7) । अतः, ई सब ऑक्सफोस के कमी वाला न्यूरॉन्स के प्राथमिकता वाला विशेषता प्रतीत होय छै, भले ही एकमात्र विशेषता नै होय, जे न्यूरोडिजनरेशन लेली महत्वपूर्ण छै । .
सेरिबेलर रोग एक विषम प्रकार के न्यूरोडिजनरेटिव रोग छै जे आमतौर पर अटैक्सिया के रूप में प्रकट होय छै आरू अक्सर पीएन के नुकसान पहुँचै छै ( 46 ). ई न्यूरॉन आबादी माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार केरऽ विशेष रूप स॑ कमजोर छै, कैन्हेंकि चूहा म॑ ओकरऽ चयनात्मक क्षय मानव स्पाइनोसेरिबेलर अटैक्सिया केरऽ विशेषता वाला बहुत सारा मोटर लक्षणऽ के पुनरुत्पादन लेली पर्याप्त छै ( 16 , 47 , 48 ). रिपोर्ट के अनुसार, एक उत्परिवर्तित जीन वाला ट्रांसजेनिक माउस मॉडल मानव स्पिनोसेरिबेलर अटैक्सिया स॑ जुड़लऽ छै आरू ओकरा म॑ माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन ( 49 , 50 ) छै, जे पीएनपीएच म॑ ऑक्सफोस के कमी के परिणाम के अध्ययन के महत्व प॑ जोर दै छै । अतः ई अद्वितीय न्यूरॉन आबादी क॑ प्रभावी ढंग स॑ अलग करी क॑ अध्ययन करै लेली विशेष रूप स॑ उपयुक्त छै । लेकिन, ई देखत॑ कि पीएन दबाव के प्रति बहुत संवेदनशील होय छै आरू पूरा सेरिबेलर कोशिका आबादी केरऽ कम अनुपात के हिस्सा छै, बहुत सारा ओमिक्स आधारित अध्ययनऽ लेली, पूरा कोशिका के रूप म॑ एकरऽ चयनात्मक पृथक्करण अखनी भी एगो चुनौतीपूर्ण पहलू छै । यद्यपि अन्य कोशिका प्रकार (विशेष रूप स॑ वयस्क ऊतक) केरऽ संदूषण केरऽ बिल्कुल कमी प्राप्त करना लगभग असंभव छै, लेकिन हमन॑ डाउनस्ट्रीम प्रोटीओमिक्स विश्लेषण लेली पर्याप्त संख्या म॑ व्यवहार्य न्यूरॉन्स प्राप्त करै लेली FACS के साथ एक प्रभावी विच्छेदन कदम के संयोजन करलकै, आरू पूरा सेरिबैलम (51) केरऽ मौजूदा डाटा सेट के तुलना म॑ काफी उच्च प्रोटीन कवरेज (लगभग 3000 प्रोटीन) छै । पूरा कोशिका केरऽ व्यवहार्यता क॑ संरक्षित करी क॑, हम्मं॑ जे विधि यहाँ उपलब्ध कराबै छियै, वू हमरा न सिर्फ माइटोकॉन्ड्रिया म॑ चयापचय मार्ग म॑ बदलाव के जांच करै के अनुमति दै छै, बल्कि अपनऽ कोशिका द्रव्य समकक्ष म॑ बदलाव के जांच करै के भी अनुमति दै छै, जे कोशिका प्रकार क॑ समृद्ध करै लेली माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली टैग के उपयोग के पूरक छै जटिल ऊतकऽ म॑ माइटोकॉन्ड्रिया के संख्या लेली नया तरीका (52, 53) । हम जे विधि के वर्णन करै छियै, वू न सिर्फ पुर्किन्जे कोशिका के अध्ययन स॑ संबंधित छै, बल्कि बीमार मस्तिष्क म॑ चयापचय परिवर्तन क॑ संबोधित करै लेली कोनो भी प्रकार के कोशिका प॑ आसानी स॑ लागू करलऽ जाब॑ सकै छै, जेकरा म॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार केरऽ अन्य मॉडल भी शामिल छै ।
अंत में, हमनें ई चयापचय पुनर्व्यवस्था प्रक्रिया के दौरान एगो चिकित्सीय खिड़की के पहचान करल॑ छै जे कोशिकीय तनाव के प्रमुख संकेतऽ क॑ पूरा तरह स॑ उलट॑ सकै छै आरू न्यूरॉनल क्षय क॑ रोकी सकै छै । अतः, यहाँ वर्णित रिवाइरिंग केरऽ कार्यात्मक निहितार्थ क॑ समझला स॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार के दौरान न्यूरॉनल व्यवहार्यता क॑ बनाए रखै लेली संभावित उपचारऽ के मौलिक जानकारी मिल॑ सकै छै । अन्य मस्तिष्क कोशिका प्रकारऽ म॑ ऊर्जा चयापचय म॑ बदलाव के विच्छेदन के उद्देश्य स॑ भविष्य केरऽ शोध के जरूरत छै ताकि ई सिद्धांत केरऽ अन्य न्यूरोलॉजिकल बीमारी प॑ प्रयोज्यता क॑ पूरा तरह स॑ पता चल॑ सक॑ ।
माइटोपार्क चूहों कें वर्णन पहिने कैल गेल छै ( 31 ). loxP फ्लैंकिंग Mfn2 जीन वाला C57BL/6N चूहों के वर्णन पहिने (18) करलऽ गेलऽ छै आरू L7-Cre चूहा (23) के साथ संकरित करलऽ गेलऽ छै । तखन परिणामस्वरूप डबल हेटरोजाइगस संतान क॑ होमोजाइगस Mfn2loxP/Mfn2loxP चूहों स॑ संकरित करी क॑ Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) लेली पुर्किन्जे-विशिष्ट जीन नॉकआउट पैदा करलऽ गेलऽ छेलै । संभोग केरऽ एक उपसमूह म॑, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP एलील (stop-mtYFP) क॑ अतिरिक्त क्रॉसिंग ( 20 ) के माध्यम स॑ पेश करलऽ गेलऽ छेलै । जानवरक कें सबटा प्रक्रियाक कें यूरोपीय, राष्ट्रीय आ संस्थागत दिशा निर्देशक कें अनुसार कैल गेलय आ जर्मनी कें उत्तरी राइन-वेस्टफेलिया कें उमवेल्ट आ वर्ब्राउचरशुट्ज कें लैंडेसामटफुरनाचर द्वारा अनुमोदित कैल गेलय. पशुअक कें काज यूरोपीय फेडरेशन ऑफ लैबोरेटरी एनिमल साइंसेज एसोसिएशन कें मार्गदर्शन कें पालन सेहो कैल जायत छै.
गर्भवती महिला कें गर्भाशय ग्रीवा कें विस्थापन कें बेहोश करला कें बाद माउस कें भ्रूण कें अलग कैल जायत छै (E13) । कॉर्टेक्स क॑ 10 एमएम हेपेस केरऽ पूरक हैनक्स केरऽ बैलेंसड साल्ट सॉल्यूशन (एचबीएसएस) म॑ विच्छेदित करलऽ गेलऽ छेलै आरू डल्बेको केरऽ मोडिफाइड ईगल केरऽ मीडियम प॑ पास करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ पपेन (20 U/ml) आरू सिस्टीन (1μg/ml) छेलै । ऊतक कें डीएमईएम मे इन्क्यूबेट करूं) आ ओकरा एंजाइमी पाचन सं अलग करूं. एमएल) 37°C पर 20 मिनट तइक, आ ओकर बाद 10% भ्रूण गोजातीय सीरम कें पूरक डीएमईएम मे यंत्रवत रूप सं मिल कैल गेलय. कोशिका क॑ इमेजिंग विश्लेषण लेली 2×106 प्रति 6 सेमी कल्चर डिश घनत्व प॑ या 0.5×105 कोशिका/सेमी2 घनत्व प॑ पॉलीलाइसिन स॑ लेपित ग्लास कवरस्लिप प॑ बीज लगाय देलऽ गेलऽ छेलै । 4 घंटा के बाद माध्यम क॑ न्यूरोबेसल सीरम-मुक्त माध्यम स॑ बदललऽ गेलै जेकरा म॑ 1% बी 27 पूरक आरू 0.5 एमएम ग्लूटामैक्स छेलै । एकरऽ बाद न्यूरॉन्स क॑ पूरा प्रयोग म॑ ३७ डिग्री सेल्सियस आरू ५% सीओ२ प॑ रखलऽ गेलै, आरू सप्ताह म॑ एक बार खिलालऽ गेलै । इन विट्रो म॑ पुनर्संयोजन क॑ प्रेरित करै लेली, इन विट्रो म॑ दोसरऽ दिन न्यूरॉन्स के इलाज लेली निम्नलिखित एएवी९ वायरस वेक्टर केरऽ 3μl (24-वेल कल्चर डिश) या 0.5μl (24-वेल प्लेट) के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै: AAV9.CMV.PI.eGFP । WPRE.bGH (एडजीन, कैटलॉग नंबर 105530-AAV9) आ AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (एडजीन, कैटलॉग नंबर 105545-AAV9)।
माउस Mfn1 आरू Mfn2 पूरक डीएनए (क्रमशः Addgene प्लाज्मिड #23212 आरू #23213 स॑ प्राप्त) क॑ C-टर्मिनस प॑ V5 अनुक्रम (GKPIPNPLLGLDST) स॑ चिह्नित करलऽ जाय छै, आरू T2A अनुक्रम के माध्यम स॑ फ्रेम म॑ mCherry स॑ फ्यूज करलऽ जाय छै । Grx1-roGFP2 हाइडलबर्ग टीपी डिक DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) केरऽ उपहार छै । पारंपरिक क्लोनिंग विधियक कें उपयोग सं tdTomato कैसेट कें बदलय सं, कैसेट कें pAAV-CAG-FLEX-tdTomato रीढ़ (Addgene संदर्भ संख्या 28306) मे सबक्लोन करल गेलय छेलै ताकि pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 आरू pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 वैक्टर। नियंत्रण वेक्टर pAAV-CAG-FLEX-mCherry उत्पन्न करै लेली भी ऐन्हऽ ही रणनीति के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै । एएवी-shPCx निर्माण क॑ उत्पन्न करै लेली, एक प्लाज्मिड एएवी वेक्टर (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) केरऽ आवश्यकता छै, जेकरा म॑ माउस PCx (5′CTTTCGCTCTCTAAGGTGCTAACCTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG) क॑ लक्षित करै वाला shRNA क॑ एन्कोडिंग करै वाला डीएनए अनुक्रम शामिल छै 3′) U6 प्रोमोटर के नियंत्रण में mCherry के प्रयोग सीएमवी प्रोमोटर के नियंत्रण में किया जाता है | सहायक एएवी वैक्टर केरऽ उत्पादन निर्माता केरऽ निर्देश (सेल बायोलैब्स) के अनुसार करलऽ गेलऽ छेलै । संक्षेप म॑, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) क॑ क्षणिक रूप स॑ 293AAV कोशिका-T2A-MFN1-V5), mCherry केरऽ संक्रमण ले जाय वाला एक स्थानांतरण प्लाज्मिड के प्रयोग करलऽ जाय (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) या Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) कोडिंग जीन, साथ ही साथ AAV1 कैप्सिड प्रोटीन आरू सहायक प्रोटीन पैकेजिंग प्लाज्मिड प्लाज्मिड कोडिंग, कैल्शियम फॉस्फेट विधि के उपयोग स॑ । कच्चा वायरस सुपरनेटेंट क॑ सूखी बर्फ/इथेनॉल स्नान म॑ फ्रीज-थॉ चक्र आरू फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) म॑ लाइज करलऽ गेलऽ कोशिका स॑ प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै । एएवी वेक्टर क॑ असंतत आयोडिक्सानॉल ढाल अल्ट्रासेन्ट्रीफ्यूजेशन (32,000 आरपीएम आरू 4 डिग्री सेल्सियस प॑ 24 घंटा) द्वारा शुद्ध करलऽ गेलऽ छेलै आरू एमिकॉन अल्ट्रा-15 अपकेंद्रित्र फिल्टर के उपयोग स॑ गाढ़ा करलऽ गेलऽ छेलै । AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 जीनोम कॉपी (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX के जीनोम टीटर पहिने वर्णित (54) के अनुसार छल, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा मापा गेल छल -MFN1-V5 (1.9×1013 जीसी/एमएल) आरू AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 जीसी/एमएल) ।
प्राथमिक न्यूरॉन्स क॑ बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस म॑ खुरचलऽ गेलऽ छेलै, गोली बनालऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद 0.5% ट्राइटन एक्स-100 / 0.5% सोडियम डिऑक्सीकोलेट/पीबीएस लाइसिस बफर म॑ समरूप करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ फॉस्फेटेज आरू प्रोटीज अवरोधक (रोचे) छेलै । प्रोटीन मात्रा निर्धारण बाइसिन्कोनिनिक एसिड परख (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै । तखन प्रोटीन क॑ एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग करलऽ गेलै, आरू ओकरा बाद पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड झिल्ली (जीई हेल्थकेयर) प॑ ब्लॉट करलऽ गेलै । गैर-विशिष्ट स्थल कें अवरुद्ध करूं आ प्राथमिक एंटीबॉडी (विवरण कें लेल तालिका S1 देखूं) कें साथ टीबीएसटी (ट्वीन कें साथ ट्रिस-बफर खारा), धोनाय कें चरण आ टीबीएसटी मे माध्यमिक एंटीबॉडी मे 5% दूध मे इन्क्यूबेट करूं. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर +4°C पर इन्क्यूबेट करें | धोलाक बाद सेकेंडरी एंटीबॉडी कें कमरा कें तापमान पर 2 घंटा तइक लगाऊं. तत्पश्चात, एक ही ब्लॉट क॑ एंटी-β-एक्टिन एंटीबॉडी स॑ इन्क्यूबेशन करी क॑ वू ही लोडिंग के पुष्टि करलऽ गेलै । केमिलुमिनेसेंस मे बदल क आ केमिलुमिनेसेंस (जीई हेल्थकेयर) बढ़ा क पता लगाबय के काज।
ग्लास कवरस्लिप पर पहिने बीज कैल गेल न्यूरॉन्स कें 4% पैराफॉर्मलडीहाइड (पीएफए)/पीबीएस सं निर्धारित समय बिंदु पर कमरा कें तापमान पर 10 मिनट तइक फिक्स कैल गेलय. कवरस्लिप कें पहिले कमरा कें तापमान पर 5 मिनट तइक 0.1% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस सं, आ फेर ब्लॉकिंग बफर [3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए)/पीबीएस] मे घुसा देल जायत छै. दोसर दिन, कवरस्लिप कें ब्लॉकिंग बफर सं धोल गेलय आ उचित फ्लोरोफोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी सं कमरा कें तापमान पर 2 घंटा तइक इन्क्यूबेट कैल गेलय; अंततः, नमूना क॑ पीबीएस म॑ 4′,6-डायमिडिनो-2 -फेनिलिंडोल (DAPI) के साथ अच्छा तरह स॑ धोलऽ गेलऽ छेलै आरू ओकरा बाद एक्वा-पॉली/माउंट स॑ माइक्रोस्कोप स्लाइड प॑ फिक्स करलऽ गेलऽ छेलै ।
चूहों (नर आ मादा) कें केटामाइन (130 मिलीग्राम/किलोग्राम) आ ज़ाइलाज़िन (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) कें इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन सं बेहोश कैल गेलय आ कार्प्रोफेन दर्द निवारक (5 मिलीग्राम/किलोग्राम) कें साथ चमड़ी कें नीचे देल गेलय , आ एकटा गर्म पैड सं लैस एकटा स्टीरियोटैक्टिक उपकरण (Kopf) मे राखल गेलय. खोपड़ी कें उजागर करूं आ दंत ड्रिल कें उपयोग सं सेरिबेलर कॉर्टेक्स कें मिस हड्डी कें अनुरूप भाग कें पतला करूं (लैम्ब्डा सं: पूंछ 1.8, पार्श्व 1, लोब्यूल IV आ V कें अनुरूप) । घुमावदार सिरिंज सुई कें उपयोग करएय कें लेल सावधानी सं खोपड़ी मे छोट छेद बनाऊं ताकि नीचा संवहनी तंत्र कें बाधित नहि भ सकएय. तखन पतला खींचल गेल कांच कें केशिका कें धीरे-धीरे माइक्रो-होल (ड्यूरा मेटर कें उदर साइड पर -1.3 सं -1 तइक) मे डालल जायत छै, आ 200 सं 300 एनएल एएवी कें माइक्रो-इंजेक्टर (नरिशिगे) मे मैनुअल सिरिंज (नरिशिगे) सं कई बेर 10 सं 20 मिनट कें समय कें अवधि मे कम दबाव पर इंजेक्ट कैल जायत छै. इन्फ्यूजन के बाद केशिका के 10 मिनट आओर राखू जाहि सं वायरस पूरा तरह सं फैल सकय. केशिका कें वापस लेवय कें बाद त्वचा कें सावधानी सं सिवनी कैल जायत छै, ताकि घाव कें सूजन कम सं कम भ सकएय आ जानवर कें ठीक भ सकएय. ऑपरेशन कें बाद कई दिन तइक जानवरक कें दर्द निवारक दवाइयक (कैस्पोफेन) सं इलाज कैल गेलय, अइ दौरान ओकर शारीरिक स्थिति कें ध्यान सं निगरानी कैल गेलय आ ओकर बाद निर्धारित समय बिंदु पर ओकर मृत्यदंड देल गेलय. सबटा प्रक्रिया यूरोपीय, राष्ट्रीय आ संस्थागत दिशा निर्देशक कें अनुसार कैल गेलय आ जर्मनी कें नॉर्थ राइन-वेस्टफेलिया कें उमवेल्ट आ वर्ब्राउचरशुट्ज कें लैंडेसामटफुरनाचर द्वारा अनुमोदित कैल गेलय.
जानवरक कें केटामाइन (100 मिलीग्राम/किलोग्राम) आ ज़ाइलाजिन (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) सं बेहोश कैल गेलय, आ दिल कें पहिले 0.1 एम पीबीएस सं, आ फेर पीबीएस मे 4% पीएफए ​​सं परफ्यूज कैल गेलय. ऊतक क॑ विच्छेदित करी क॑ 4% पीएफए/पीबीएस म॑ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस प॑ फिक्स करलऽ गेलऽ छेलै । पीबीएस म॑ स्थिर मस्तिष्क स॑ धनुषी खंड (50 माइक्रोन मोटाई) तैयार करै लेली कंपन चाकू (लेइका माइक्रोसिस्टम्स जीएमबीएच, वियना, ऑस्ट्रिया) के प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । जब तलक अन्यथा निर्दिष्ट नै करलऽ गेलऽ होय, मुक्त-फ्लोटिंग खंडऽ के धुंधलापन कमरा के तापमान आरू हलचल प॑ ऊपर वर्णित (13) के अनुसार करलऽ गेलऽ छेलै । संक्षेप मे, पहिने, प्राप्त स्लाइस कें 0.5% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस सं कमरा कें तापमान पर 15 मिनट कें लेल पारगम्य बना देल गेलय; कुछ एपिटोप (Pcx आरू Shmt2) के लेलऽ, द्वारा 80°C (PH 9) प॑ tris-EDTA बफर म॑ स्लाइस क॑ ई चरण के बजाय 25 मिनट तलक गरम करलऽ जाय । अगिला, खंडक कें प्राथमिक एंटीबॉडी (देखूं तालिका S1) कें साथ ब्लॉकिंग बफर (3% बीएसए/पीबीएस) मे 4°C पर रात भर हलचल कें साथ इन्क्यूबेट करल गेलय. अगिला दिन, खंडक कें ब्लॉकिंग बफर सं धोल गेलय आ उचित फ्लोरोफोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी सं कमरा कें तापमान पर 2 घंटा तइक इन्क्यूबेट कैल गेलय; अंततः, खंड क॑ पीबीएस म॑ अच्छा तरह स॑ धोलऽ गेलै, डीएपीआई स॑ काउंटर-स्टेन करलऽ गेलै, आरू ओकरा बाद एक्वापॉलीमाउंट स॑ फिक्स करलऽ गेलै एक माइक्रोस्कोप स्लाइड प॑ ।
नमूना केरऽ इमेजिंग लेली लेजर स्कैनिंग कॉनफोकल माइक्रोस्कोप (टीसीएस एसपी८-एक्स या टीसीएस डिजिटल लाइट शीट, लीका माइक्रोसिस्टम्स) के इस्तेमाल करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ सफेद प्रकाश लेजर आरू ४०५ डायोड पराबैंगनी लेजर छेलै । फ्लोरोफोर क॑ उत्तेजित करी क॑ आरू हाइब्रिड डिटेक्टर (HyDs) स॑ संकेत क॑ एकत्रित करी क॑, LAS-X सॉफ्टवेयर के उपयोग क्रमिक मोड म॑ नाइकिस्ट नमूनाकरण के अनुरूप ढेर छवि इकट्ठा करै लेली करलऽ गेलऽ छेलै: गैर-मात्रा पैनल के लेलऽ, ई अत्यधिक गतिशील संकेत छै (उदाहरण के लेलऽ, दैहिक कोशिका आरू डेंड्राइट्स म॑) mtYFP) BrightR मोड म॑ पीएन के संख्या के पता लगाबै लेली HyD के प्रयोग करलऽ जाय) । बैकग्राउंड कम करय कें लेल 0.3 सं 6 ns तइक गेटिंग लागू कैल जायत छै.
क्रमबद्ध कोशिकाओं के वास्तविक समय इमेजिंग। 1% B27 पूरक आरू 0.5 mM GlutaMax युक्त न्यूरोबेसल-ए माध्यम म॑ छंटनी के बाद, कोशिका क॑ तुरंत पॉली-एल-लाइसिन-लेपित ग्लास स्लाइड (μ-Slide8 Well, Ibidi, कैटलॉग नंबर 80826) प॑ बीज लगाय देलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद ओकरा 37°C आरू 5% CO2 प॑ 1 घंटा तलक रखलऽ गेलऽ छेलै ताकि कोशिका क॑ बसै के अनुमति मिल॑ सक॑ । रियल-टाइम इमेजिंग क॑ लीका एसपी 8 लेजर स्कैनिंग कॉनफोकल माइक्रोस्कोप प॑ करलऽ गेलऽ छेलै जे सफेद लेजर, हाइडी, 63×[1.4 न्यूमेरिकल एपर्चर (एनए)] ऑयल ऑब्जेक्टिव लेंस आरू हीटिंग स्टेज स॑ लैस छेलै ।
माउस क॑ जल्दी स॑ कार्बन डाइऑक्साइड स॑ बेहोश करी क॑ सिर काटलऽ गेलै, मस्तिष्क क॑ जल्दी स॑ खोपड़ी स॑ हटाय देलऽ गेलै, आरू 200μm मोटाई (13C लेबलिंग प्रयोग लेली) या 275μm मोटाई (दू फोटॉन प्रयोग लेली) धनुषी खंड म॑ काटलऽ गेलै जेकरा म॑ निम्नलिखित सामग्री भरलऽ गेलै The ice cream (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) निम्नलिखित पदार्थक सं भरल जायत छै: 125 mM बर्फ-ठंडा, कार्बन-संतृप्त (95% O2 आ 5% CO2) कम Ca2 + कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25 mM NaHCO3, 25 mM ग्लूकोज, 0.5 mM CaCl2 आ 3.5 mM MgCl2 (310 स 330 mmol के आसमाटिक दबाव)। प्राप्त मस्तिष्क स्लाइस कें उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 आ 2.0 mM MgCl2) वाला प्री-इन्क्यूबेशन कक्ष मे स्थानांतरित करूं. मध्यम) पीएच 7.4 आ 310 सँ 320 मिलीमोल)।
इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, स्लाइस क॑ एक समर्पित इमेजिंग रूम म॑ स्थानांतरित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू प्रयोग क॑ लगातार एसीएसएफ परफ्यूजन के तहत 32° स॑ 33°C के स्थिर तापमान प॑ करलऽ गेलऽ छेलै । स्लाइस इमेजिंग लेली लाइका 25x ऑब्जेक्टिव लेंस (एनए 0.95, पानी) स॑ लैस मल्टीफोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (टीसीएस एसपी8 एमपी-ओपीओ, लीका माइक्रोसिस्टम्स), Ti: नीलम लेजर (गिरगिट विजन II, कोहेरेंट) के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै । FLIM मॉड्यूल (PicoHarp300, PicoQuant)।
Grx1-roGFP2 के FLIM। पीएन केरऽ साइटोप्लाज्मिक रेडॉक्स स्टेट म॑ बदलाव क॑ सैजिटल ब्रेन स्लाइस म॑ दू-फोटॉन एफएलआईएम द्वारा मापलऽ गेलऽ छेलै, जहां Grx1-roGFP2 बायोसेंसर न॑ पीएन क॑ लक्षित करलकै । पीएन परत म॑, अधिग्रहण क्षेत्र क॑ स्लाइस सतह स॑ लगभग 50 स॑ 80 माइक्रोन नीचें चुनलऽ जाय छै ताकि ई सुनिश्चित करलऽ जाय सक॑ कि एक व्यवहार्य पीएन (अर्थात, डेंड्राइट्स के साथ मनका संरचना या न्यूरॉनल आकृति संबंधी परिवर्तन के कमी) आरू डबल पॉजिटिव roGFP2 संवेदक आरू एएवी एन्कोडिंग shRNA PCx या ओकरऽ नियंत्रण अनुक्रम (प्रत्येक सह-अभिव्यक्त करय वाला mCherry) छै । 2x डिजिटल जूम [उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 890 एनएम; ५१२ एनएम ५१२ पिक्सेल]। पता लगाना: आंतरिक HyD, फ्लोरोसेन आइसोथियोसाइनेट (FITC) फिल्टर समूह] आरू 2 स॑ 3 मिनट के भीतर छवि औसतन के उपयोग ई सुनिश्चित करै लेली करलऽ जाय छै कि वक्र फिटिंग लेली पर्याप्त फोटॉन एकत्रित करलऽ जाय (कुल 1000 फोटॉन) । Grx1-roGFP2 जांच केरऽ संवेदनशीलता आरू FLIM परिस्थिति केरऽ सत्यापन roGFP2 केरऽ जीवनकाल मान केरऽ निगरानी करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै जब॑ परफ्यूजन ACSF म॑ बहिर्जात 10 mM H2O2 जोड़लऽ गेलऽ छेलै (ऑक्सीकरण क॑ अधिकतम करै लेली, जेकरऽ परिणामस्वरूप जीवन काल म॑ वृद्धि होय छै), आरू ओकरा बाद 2 mM डाइथियोथ्राइटोल जोड़लऽ जाय छै (कम करय के डिग्री क॑ कम करी दै छै, जेकरऽ परिणामस्वरूप कमी होय छै जीवन काल में) (चित्र S8, D से G)। अर्जित परिणामक कें विश्लेषण करय कें लेल FLIMfit 5.1.1 सॉफ्टवेयर कें उपयोग करूं, पूरा छवि कें एकल घातीय क्षय वक्र कें मापल गेलय आईआरएफ (इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फंक्शन) पर फिट करूं, आ χ2 लगभग 1. एकल पीएन कें जीवनकाल कें गणना करय कें लेल, तंत्रिका शरीर कें आसपास कें मास्क कें मैन्युअल रूप सं खींचल गेलय, आ प्रत्येक मास्क मे औसत जीवनकाल कें उपयोग मात्रा निर्धारण कें लेल करल गेलय छेलै.
माइटोकॉन्ड्रिया संभावित विश्लेषण। तीव्र खंड क॑ सीधे परफ्यूज एसीएसएफ म॑ मिलालऽ गेलऽ 100 एनएम टीएमआरएम स॑ 30 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करला के बाद पीएन केरऽ माइटोकॉन्ड्रिया संभावित परिवर्तन क॑ दू-फोटॉन माइक्रोस्कोप स॑ मापलऽ गेलऽ छेलै । टीएमआरएम इमेजिंग क॑ 920 एनएम प॑ जांच क॑ उत्तेजित करी क॑ आरू संकेत एकत्रित करै लेली आंतरिक HyD (टेट्रामिथाइलरोडामाइन आइसोथियोसाइनेट: 585/40 एनएम) के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै; एक ही उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के उपयोग करकय लेकिन mtYFP क॑ छवि बनाबै लेली एक अलग आंतरिक HyD (FITC :525/50) के उपयोग करी क॑ । एकल कोशिका स्तर पर माइटोकॉन्ड्रिया क्षमता कें मूल्यांकन करय कें लेल इमेजजे कें इमेज कैलकुलेटर प्लग-इन कें उपयोग करूं. संक्षेप म॑, प्लग-इन समीकरण: सिग्नल = min (mtYFP, TMRM) के उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्र के पहचान करै लेली करलऽ जाय छै जे संबंधित चैनल केरऽ सिंगल-स्टैक कॉनफोकल छवि म॑ पुर्किन्जे सोमाली म॑ टीएमआरएम सिग्नल क॑ दर्शाबै छै । तखन परिणामस्वरूप मास्क म॑ पिक्सेल क्षेत्र क॑ मात्रा निर्धारित करलऽ जाय छै, आरू ओकरा बाद mtYFP चैनल केरऽ संबंधित थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टैक छवि प॑ सामान्य करलऽ जाय छै ताकि माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विभव दिखाबै वाला माइटोकॉन्ड्रिया अंश प्राप्त करलऽ जाय सक॑ ।
छवि क॑ ह्यूजेंस प्रो (साइंटिफिक वॉल्यूम इमेजिंग) सॉफ्टवेयर स॑ डिकॉन्वोल्यूट करलऽ गेलऽ छेलै । टाइल्स कें स्कैन कैल गेल चित्रक कें लेल एकटा टाइल कें मोंटाज लास-एक्स सॉफ्टवेयर दूवारा उपलब्ध करायल गेल स्वचालित सिलाई एल्गोरिदम कें उपयोग सं कैल जायत छै. छवि कैलिब्रेशन के बाद इमेजजे आरू एडोब फोटोशॉप के उपयोग करी क॑ इमेज क॑ आरू प्रोसेस करी क॑ चमक आरू कंट्रास्ट क॑ एक समान रूप स॑ एडजस्ट करलऽ जाय । ग्राफिक तैयारी के लिये एडोब इलस्ट्रेटर का प्रयोग करे |
mtDNA फोकस विश्लेषण। कॉनफोकल माइक्रोस्कोप द्वारा डीएनए के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल करलऽ गेलऽ सेरिबेलर खंडऽ प॑ mtDNA घाव के संख्या के मात्रा निर्धारित करलऽ गेलऽ छेलै । प्रत्येक लक्ष्य क्षेत्र क॑ कोशिका शरीर आरू प्रत्येक कोशिका केरऽ नाभिक लेली बनालऽ गेलऽ छेलै, आरू संबंधित क्षेत्र केरऽ गणना मल्टी मेजर प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेयर) के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । कोशिका शरीर क्षेत्रफल से नाभिकीय क्षेत्र घटाकर कोशिका द्रव्य क्षेत्र प्राप्त करें | अंततः, एनालाइज पार्टिकल्स प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेयर) के उपयोग थ्रेशोल्ड इमेज प॑ mtDNA क॑ इंगित करै वाला साइटोप्लाज्मिक डीएनए बिंदु क॑ स्वचालित रूप स॑ मात्राबद्ध करै लेली करलऽ गेलऽ छेलै, आरू प्राप्त परिणाम क॑ सीटीआरएल चूहऽ के पीएन औसत प॑ सामान्य करलऽ गेलऽ छेलै । परिणाम प्रति कोशिका न्यूक्लियोसाइड के औसत संख्या के रूप में व्यक्त करलऽ जाय छै ।
प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। एकल कोशिका स्तर पर पीएन मे प्रोटीन अभिव्यक्ति कें मूल्यांकन करय कें लेल इमेजजे कें इमेज कैलकुलेटर प्लग-इन कें उपयोग करूं. संक्षेप म॑, संबंधित चैनल केरऽ एकल-परत कॉनफोकल छवि म॑, समीकरण: सिग्नल = min (mtYFP, एंटीबॉडी) के माध्यम स॑, माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्र जे पुर्किना म॑ एगो निश्चित एंटीबॉडी के प्रति इम्यूनोरिएक्टिविटी दिखाबै छै, के पहचान करलऽ जाय छै । तखन परिणामस्वरूप मास्क म॑ पिक्सेल क्षेत्र क॑ मात्रा निर्धारित करलऽ जाय छै, आरू ओकरा बाद mtYFP चैनल केरऽ संबंधित थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टैक छवि प॑ सामान्य करलऽ जाय छै ताकि प्रदर्शित प्रोटीन केरऽ माइटोकॉन्ड्रिया अंश प्राप्त करलऽ जाय सक॑ ।
पुर्किन्जे कोशिका घनत्व विश्लेषण। इमेजजे केरऽ सेल काउंटर प्लग-इन केरऽ उपयोग पुर्किन्जे घनत्व के मूल्यांकन लेली करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा म॑ गिनल गेलऽ कोशिका द्वारा कब्जा करलऽ गेलऽ सेरिबेलर रिंग केरऽ लंबाई स॑ विभाजित करलऽ गेलऽ छेलै ।
नमूना तैयारी एवं संग्रहण। नियंत्रण समूह आरू Mfn2cKO चूहों स॑ मस्तिष्क क॑ 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी) म॑ 2% पीएफए/2.5% ग्लूटारएलडीहाइड म॑ तय करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद कोरोनल खंड क॑ सिलिएट्स (Leica Mikrosysteme GmbH, वियना, ऑस्ट्रिया) (मोटाई 50 स॑ 60 माइक्रोन) के उपयोग करी क॑ तैयार करलऽ गेलऽ छेलै, तखनिये 1% ऑस टेट्राऑक्साइड म॑ पीबी बफर म॑ फिक्स करलऽ गेलऽ छेलै आरू 1.5% पोटेशियम फेरोसायनाइड कमरा के तापमान पर 1 घंटा तक। खंडक कें आसुत जल सं तीन बेर धोल गेलय, आ ओकर बाद 20 मिनट तइक 1% यूरेनाइल एसीटेट युक्त 70% इथेनॉल सं रंगल गेलय. तखन खंडक कें ग्रेडड अल्कोहल मे निर्जलीकरण करल गेलय आ सिलिकॉन लेपित ग्लास स्लाइड कें बीच डुरकुपन एसीएम (अराल्डाइट कास्टिंग रेजिन एम) इपोक्सी राल (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी साइंसेज, कैटलॉग नंबर 14040) मे एम्बेड करल गेलय, आ अंत मे 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन मे 48 घंटा तइक पॉलिमराइज करल गेलय. सेरिबेलर कॉर्टेक्स क्षेत्र क॑ चुनलऽ गेलै आरू 50 एनएम अल्ट्राथिन खंड क॑ लीका अल्ट्राकट (लेइका माइक्रोसिस्टम जीएमबीएच, वियना, ऑस्ट्रिया) प॑ काटलऽ गेलै आरू पॉलीस्टायरीन फिल्म स॑ लेपित 2×1 मिमी तांबा केरऽ स्लिट ग्रिड प॑ चुनलऽ गेलै । खंडक कें H2O मे 4% यूरेनिल एसीटेट कें घोल सं 10 मिनट तइक रंगल गेलय, H2O सं कई बेर धोल गेलय, फेर H2O मे रेनॉल्ड्स सीसा साइट्रेट सं 10 मिनट तइक धोल गेलय, आ फेर H2O सं कई बेर धोल गेलय. माइक्रोग्राफ क॑ ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप फिलिप्स सीएम१०० (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, अमेरिका) स॑ टीवीआईपीएस (टिएट्ज वीडियो आरू इमेज प्रोसेसिंग सिस्टम) टेमकैम-एफ४१६ डिजिटल कैमरा (टीवीआईपीएस जीएमबीएच, गॉटिंग, अमेरिका) के उपयोग करी क॑ लेलऽ गेलऽ छेलै । जर्मनी)।
एएवी सं संक्रमित चूहों के लेलऽ मस्तिष्क क॑ अलग करी क॑ १ मिमी मोटाई के धनुषी खंड म॑ काटलऽ गेलऽ छेलै, आरू एएवी संक्रमित अंगूठी (अर्थात, mCherry एक्सप्रेसिंग) के पहचान करै लेली फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के उपयोग करी क॑ सेरिबैलम के जांच करलऽ गेलऽ छेलै । केवल ऐन्हऽ प्रयोगऽ के प्रयोग करलऽ जाय छै, जेकरा म॑ एएवी इंजेक्शन के परिणामस्वरूप कम स॑ कम लगातार दू सेरिबेलर रिंग म॑ पुर्किन्जे कोशिका परत (अर्थात लगभग पूरा परत) केरऽ बहुत अधिक संप्रेषण दक्षता होय छै । एएवी-ट्रांसड्यूस्ड लूप क॑ रात भर पोस्ट-फिक्सेशन (0.1 एम कोकोएट बफर म॑ 4% पीएफए ​​आरू 2.5% ग्लूटारएलडीहाइड) लेली माइक्रोडिसेक्टेड करलऽ गेलऽ छेलै आरू आगू संसाधित करलऽ गेलऽ छेलै । ईपीओएन एम्बेडिंग कें लेल, स्थिर ऊतक कें 0.1 एम सोडियम कोकोएट बफर (एप्लिकेम) सं धोल गेलय, आ 0.1 एम सोडियम कोकोएट बफर (एप्लीचेम) ​​मे 2% OsO4 (os, साइंस सर्विसेज; काको) सं 4 घंटा इन्क्यूबेट करल गेलय, तखन 2 घंटा तइक धोल गेलय. 0.1 M कोकामाइड बफर के साथ 3 बार दोहराएँ | तत्पश्चात, इथेनॉल केरऽ आरोही श्रृंखला के उपयोग करी क॑ ऊतक क॑ निर्जलीकरण करै लेली हर इथेनॉल घोल क॑ 4°C प॑ 15 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । ऊतक क॑ प्रोपलीन ऑक्साइड म॑ स्थानांतरित करी क॑ रात भर ईपीएन (सिग्मा-एल्ड्रिच) म॑ ४ डिग्री सेल्सियस प॑ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलै । ऊतक कें ताजा ईपीएन मे कमरा कें तापमान पर 2 घंटा तइक राखूं, आ ओकर बाद ओकरा 62 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटा तइक एम्बेड करूं. 70 एनएम अल्ट्राथिन खंडक कें काटय कें लेल अल्ट्रामाइक्रोटोम (Leica Microsystems, UC6) आ हीरा कें चाकू (Diatome, Biel, Switzerland) कें उपयोग करूं, आ 1.5% यूरेनाइल एसीटेट सं 37°C पर 15 मिनट तइक दाग करूं, आ सीसा साइट्रेट घोल सं 4 मिनट कें लेल दाग करूं. इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ कैमरा वनव्यू 4K 16-बिट (गटन) आरू डिजिटलमाइक्रोग्राफ सॉफ्टवेयर (गटन) स॑ लैस जेईएम-2100 प्लस ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (जेईओएल) के उपयोग करी क॑ लेलऽ गेलऽ छेलै । विश्लेषण के लेल इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ 5000× या 10,000× डिजिटल जूम के साथ प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै ।
माइटोकॉन्ड्रिया के आकृति विज्ञान विश्लेषण। सब विश्लेषण के लेलऽ इमेजजे सॉफ्टवेयर के उपयोग करी क॑ डिजिटल छवि म॑ व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के समोच्च क॑ मैन्युअल रूप स॑ रेखांकित करलऽ गेलऽ छेलै । विभिन्न रूपात्मक पैरामीटर के विश्लेषण कयल गेल अछि | माइटोकॉन्ड्रिया घनत्व क॑ प्रत्येक कोशिका केरऽ कुल माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्र क॑ कोशिका द्रव्य क्षेत्र (कोशिका द्रव्य क्षेत्र = कोशिका क्षेत्र-कोशिका नाभिक क्षेत्र) × 100 स॑ विभाजित करी क॑ प्राप्त प्रतिशत के रूप म॑ व्यक्त करलऽ जाय छै ।माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ गोलाई केरऽ गणना सूत्र [4π∙(क्षेत्रफल/परिधि 2)] स॑ करलऽ जाय छै । माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ इस्टा आकृति विज्ञान के विश्लेषण करी क॑ ओकरऽ मुख्य आकार के अनुसार दू श्रेणी (“ट्यूबुलर” आरू “ब्लिस्टर”) म॑ विभाजित करलऽ गेलै ।
ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संख्या एवं घनत्व विश्लेषण। डिजिटल इमेज मे प्रत्येक ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम कें समोच्च कें मैन्युअल रूप सं रूपरेखा तैयार करय कें लेल इमेजजे सॉफ्टवेयर कें उपयोग करूं. ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम क्षेत्र क॑ प्रत्येक कोशिका केरऽ कुल ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संरचना क्षेत्र क॑ कोशिका द्रव्य क्षेत्र (कोशिका द्रव्य क्षेत्र=कोशिका क्षेत्र-नाभिक क्षेत्र)×100 स॑ विभाजित करी क॑ गणना करलऽ गेलऽ प्रतिशत के रूप म॑ व्यक्त करलऽ जाय छै । ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम के घनत्व के गणना कुल संख्या के प्रति कोशिका ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संरचना के संख्या (कोशिका द्रव्य क्षेत्र के संदर्भ में) (कोशिका द्रव्य क्षेत्र = कोशिका क्षेत्र-नाभिकीय क्षेत्र) स॑ विभाजित करी क॑ करलऽ जाय छै ।
तीव्र अनुभागीकरण आ नमूना तैयार करबाक लेल लेबलिंग। प्रयोगक कें लेल जेकरा मे ग्लूकोज लेबलिंग कें आवश्यकता होयत छै, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस कें एकटा प्री-इन्क्यूबेशन कक्ष मे स्थानांतरित करूं, जेकरा मे संतृप्त कार्बन (95% O2 आ 5% CO2), उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM होयत छै d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl 2 आरू 2.0 mM MgCl 2, pH 7.4 आरू 310 स॑ 320 mOsm तलक समायोजित), जेकरा म॑ ग्लूकोज 13 C 6- ग्लूकोज प्रतिस्थापन (Eurisotop, कैटलॉग नंबर CLM-1396) छै । प्रयोगक कें लेल जेकरा मे पाइरुवेट लेबलिंग कें आवश्यकता होयत छै, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस कें उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 आ 2.0mM जोड़ूं मे स्थानांतरित करूं MgCl2, पीएच 7.4 आरू 310 स॑ 320mOsm तलक समायोजित करलऽ जाय, आरू 1mM 1-[1-13C]पाइरुवेट (Eurisotop, कैटलॉग नंबर CLM-1082) जोड़लऽ जाय । खंडक कें 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट तइक इन्क्यूबेट करूं. प्रयोग के अंत म॑, खंडऽ क॑ जल्दी स॑ 75 एमएम अमोनियम कार्बोनेट वाला जलीय घोल (पीएच 7.4) स॑ धोलऽ गेलै, आरू ओकरा बाद 40:40:20 (v:v:v) एसीटोनिट्राइल (ACN): मेथनॉल: पानी म॑ समरूप करलऽ गेलै । खंड क॑ बर्फ प॑ 30 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करला के बाद नमूना क॑ 21,000 ग्राम प॑ 4°C प॑ 10 मिनट तलक अपकेंद्रित्रित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू स्पष्ट सुपरनेटेंट क॑ स्पीडवैक कंसेन्ट्रेटर म॑ सुखायलऽ गेलऽ छेलै । परिणामस्वरूप सूखल मेटाबोलाइट गोली कें विश्लेषण तइक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कैल गेलय.
13 सी-लेबल अमीनो एसिड के तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण | तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) विश्लेषण के लेल, मेटाबोलाइट गोली क॑ 75μl एलसी-एमएस ग्रेड पानी (हनीवेल) म॑ पुनः निलंबित करलऽ गेलऽ छेलै । 4°C प॑ 21,000 ग्राम प॑ 5 मिनट तलक अपकेंद्रित्रण के बाद, 20 μl स्पष्ट सुपरनेटेंट क॑ अमीनो एसिड फ्लक्स विश्लेषण लेली प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै, जबकि बाकी अर्क क॑ तुरंत आयन विश्लेषण लेली प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै (नीचा देखऽ) । अमीनो एसिड विश्लेषण पहिने वर्णित बेंजोइल क्लोराइड व्युत्पन्नीकरण प्रोटोकॉल ( 55 , 56 ) के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै । पहिलऽ चरण म॑ 20μl मेटाबोलाइट अर्क म॑ 10μl 100 mM सोडियम कार्बोनेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) मिलालऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद एलसी ग्रेड एसीएन म॑ 10μl 2% बेंजोइल क्लोराइड (सिग्मा-एल्ड्रिच) मिलालऽ गेलऽ छेलै । नमूना क॑ संक्षेप म॑ भंवर लगाय देलऽ गेलै आरू ओकरा बाद 21,000 ग्राम प॑ 20 डिग्री सेल्सियस प॑ 5 मिनट तलक अपकेंद्रित्रित करलऽ गेलै । साफ सुपरनेटेंट कें शंक्वाकार ग्लास इन्सर्ट (200 μl आयतन) कें साथ 2 मिलीलीटर ऑटोसैंपलर शीशी मे स्थानांतरित करूं. नमूना के विश्लेषण क्यू-एक्सएक्टिव (क्यूई)-एचएफ (अल्ट्रा हाई फील्ड ऑर्बिट्रैप) हाई-रिजोल्यूशन परिशुद्धता मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) स॑ जुड़लऽ एक्विटी आईक्लास अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस एलसी सिस्टम (वाटर्स) के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । विश्लेषण के लेलऽ व्युत्पन्न नमूना के 2μl क॑ 100×1.0 मिमी उच्च ताकत वाला सिलिका टी 3 कॉलम (पानी) म॑ इंजेक्ट करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ 1.8μm कण छेलै । प्रवाह दर 100μl/min छै, आरू बफर प्रणाली म॑ बफर ए (पानी म॑ 10 mM अमोनियम फॉर्मेट आरू 0.15% फॉर्मिक एसिड) आरू बफर बी (ACN) शामिल छै । ढाल निम्नलिखित अछि : 0%B 0 मिनट पर; 0% बी। 0 सँ 0.1 मिनट मे 0 सँ 15% बी; 0.1 सँ 0.5 मिनट मे 15 सँ 17% बी; बी 0.5 सँ 14 मिनट पर 17 सँ 55% पर; बी 14 सँ 14.5 मिनट मे 55 सँ 70% पर; 18 मिनट मे 14.5 सँ 70 सँ 100% बी पर; 18 सँ 19 मिनट मे 100% बी; 19 सँ 19.1 मिनट मे 100 सँ 0% बी; 0% बी 19.1 से 28 मिनट (55, 56) पर। क्यूई-एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर सकारात्मक आयनीकरण मोड म॑ काम करै छै जेकरऽ द्रव्यमान सीमा m/z (द्रव्यमान/चार्ज अनुपात) 50 स॑ 750 छै.लागू रिजोल्यूशन 60,000 छै, आरू प्राप्त लाभ नियंत्रण (AGC) आयन लक्ष्य 3×106 छै, आरू अधिकतम आयन समय 100 मिलीसेकंड छै. गरम इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत 3.5 केवी कें स्प्रे वोल्टेज, 250 डिग्री सेल्सियस कें केशिका तापमान, 60 एयू (मनमानी इकाइयक) कें म्यान वायु प्रवाह, आ 20 एयू कें सहायक वायु प्रवाह पर संचालित होयत छै. 250 डिग्री सेल्सियस। एस लेंस 60 एयू पर सेट अछि।
13C लेबल कार्बनिक अम्ल के आयन क्रोमैटोग्राफी-एमएस विश्लेषण | शेष मेटाबोलाइट अवक्षेप (55μl) क॑ क्यूई-एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) स॑ जुड़लऽ डायोनेक्स आयन क्रोमैटोग्राफी सिस्टम (आईसीएस 5000+, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के उपयोग करी क॑ विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै । संक्षेप म॑, 5μl मेटाबोलाइट अर्क क॑ एचपीएलसी (2 मिमी×250 मिमी, कण आकार 4μm, थर्मो फिशर साइंटिफिक) स॑ लैस डायोनेक्स आयनपैक एएस11-एचसी कॉलम म॑ इंजेक्ट करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ पुश-इन आंशिक लूप मोड म॑ 1. ) डायोनेक्स आयनपैक एजी11-एचसी गार्ड कॉलम (2 मिमी x 50 मिमी, 4μm, थेर्मो फिशर वैज्ञानिक)। स्तंभ केरऽ तापमान ३० डिग्री सेल्सियस प॑ रखलऽ जाय छै, आरू ऑटोसैंपलर क॑ ६ डिग्री सेल्सियस प॑ सेट करलऽ जाय छै । इल्यूएंट जनरेटर कें माध्यम सं पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड ढाल पैदा करय कें लेल विआयनीकृत पानी सं उपलब्ध करायल गेल पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड कारतूस कें उपयोग करूं. 380μl/मिनट कें प्रवाह दर पर मेटाबोलाइट्स कें पृथक्करण, निम्नलिखित ढाल लागू करनाय: 0 सं 3 मिनट, 10 एमएम KOH; 3 स 12 मिनट, 10 स 50 मिमी केओएच; 12 स 19 मिनट, 50 स 100 मिमी केओएच; 19 से 21 मिनट , 100 मिमी केओएच; 21 से 21.5 मिनट, 100 से 10 मिमी केओएच। स्तंभ क॑ 10 mM KOH के तहत 8.5 मिनट तलक पुनः संतुलित करलऽ गेलऽ छेलै ।
इल्यूट करलऽ गेलऽ मेटाबोलाइट्स क॑ कॉलम के बाद 150μl/min आइसोप्रोपानोल पूरक धारा स॑ जोड़लऽ जाय छै आरू ओकरा बाद नकारात्मक आयनीकरण मोड म॑ संचालित उच्च रिजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर प॑ निर्देशित करलऽ जाय छै । एमएस 60,000 के रिजोल्यूशन के संग m/z 50 सं 750 तक के द्रव्यमान रेंज के निगरानी क रहल अछि. एजीसी क॑ 1×106 प॑ सेट करलऽ गेलऽ छै, आरू अधिकतम आयन समय क॑ 100 एमएस प॑ रखलऽ गेलऽ छै । गरम ईएसआई स्रोत क॑ 3.5 केवी के स्प्रे वोल्टेज प॑ संचालित करलऽ गेलऽ छेलै । आयन स्रोत केरऽ अन्य सेटिंग्स निम्नलिखित छै: केशिका तापमान २७५°C; म्यान गैस प्रवाह, 60 एयू; सहायक गैस प्रवाह, 300°C पर 20 AU, आ S लेंस 60 AU पर सेटिंग |
13C लेबल मेटाबोलाइट्स के डेटा विश्लेषण। आइसोटोप अनुपात कें डाटा विश्लेषण कें लेल ट्रेसफाइंडर सॉफ्टवेयर (संस्करण 4.2, थर्मो फिशर साइंटिफिक) कें उपयोग करूं. प्रत्येक यौगिक के पहचान एक विश्वसनीय संदर्भ यौगिक द्वारा सत्यापन करलऽ गेलऽ छेलै आरू स्वतंत्र रूप स॑ विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै । आइसोटोप संवर्धन विश्लेषण करै लेली हर 13C आइसोटोप (Mn) केरऽ निकाललऽ गेलऽ आयन क्रोमैटोग्राम (XIC) केरऽ क्षेत्रफल क॑ [M + H] + स॑ निकाललऽ गेलऽ छेलै, जहाँ n लक्ष्य यौगिक केरऽ कार्बन संख्या छै, जेकरऽ उपयोग अमीनो एसिड के विश्लेषण करै लेली करलऽ जाय छै या [ MH] + के उपयोग आयन के विश्लेषण करै लेली करलऽ जाय छै । एक्सआईसी केरऽ द्रव्यमान सटीकता पांच भाग प्रति मिलियन स॑ कम छै, आरू आरटी केरऽ सटीकता ०.०५ मिनट छै । संवर्धन विश्लेषण प्रत्येक पता चलल समस्थानिक के अनुपात आरू संबंधित यौगिक के सब समस्थानिक के योग के गणना करी क॑ करलऽ जाय छै । ई अनुपात प्रत्येक समस्थानिक के लेलऽ प्रतिशत मान के रूप म॑ देलऽ गेलऽ छै, आरू परिणाम मोलर प्रतिशत संवर्धन (MPE) के रूप म॑ व्यक्त करलऽ गेलऽ छै, जैसनऽ कि पहले वर्णित छै (42) ।
जमे हुए न्यूरॉन गोली क॑ बर्फ-ठंडा 80% मेथनॉल (v/v) म॑ समरूप बनालऽ गेलऽ छेलै, भंवर म॑ डाललऽ गेलऽ छेलै, आरू -20°C प॑ 30 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । नमूना कें फेर सं भंवर मे डालूं आ +4°C पर 30 मिनट तइक हिलाऊं. नमूना क॑ 21,000 ग्राम प॑ 4 डिग्री सेल्सियस प॑ 5 मिनट तलक अपकेंद्रित्रित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद परिणामस्वरूप सुपरनेटेंट क॑ एकत्रित करी क॑ बाद म॑ विश्लेषण लेली 25 डिग्री सेल्सियस प॑ स्पीडवैक कंसेन्ट्रेटर के उपयोग करी क॑ सुखायलऽ गेलऽ छेलै । जैना कि ऊपर वर्णित छै, छंटनी करलऽ गेलऽ कोशिका के अमीनो एसिड प॑ एलसी-एमएस विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै । ट्रेसफाइंडर (संस्करण 4.2, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के उपयोग करी क॑ हर यौगिक केरऽ मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान के उपयोग करी क॑ डाटा विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै । मेटाबोलाइट डेटा के क्वांटाइल सामान्यीकरण preprocessCore सॉफ्टवेयर पैकेज (57) के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै ।
स्लाइस तैयारी। माउस क॑ जल्दी स॑ कार्बन डाइऑक्साइड स॑ बेहोश करी क॑ सिर काटलऽ गेलै, मस्तिष्क क॑ जल्दी स॑ खोपड़ी स॑ हटाय देलऽ गेलै, आरू बर्फ स॑ भरलऽ कंपन चाकू (एचएम-६५० वी, थर्मो फिशर साइंटिफिक, वालडॉर्फ, जर्मनी) के इस्तेमाल करी क॑ ओकरा ३०० स॑ ३७५ माइक्रोन धनुषी खंड म॑ काटलऽ गेलै कोल्ड कार्बन गैसीकरण (९५% ओ२ आरू ५% सीओ२) कम Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 आरू 6.0 mM MgCl2 पीएच 7.4 आरू 310 स॑ 330 mOsm प॑ समायोजित करलऽ जाय) । प्राप्त मस्तिष्क स्लाइस कें एकटा कक्ष मे स्थानांतरित करूं जइ मे उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 4.0 mM CaCl2 आ mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 आ 310 से 320 एमओएसएम)। स्लाइस कें 20 सं 30 मिनट तइक स्टोर करूं ताकि रिकॉर्डिंग सं पहिले ओकरा बहाल कैल जा सकएय.
रिकॉर्डिंग करब। सब रिकॉर्डिंग लेली एगो फिक्स्ड रिकॉर्डिंग चैम्बर आरू 20x वाटर इमर्सन ऑब्जेक्टिव लेंस (साइंटिफिका) स॑ लैस माइक्रोस्कोप स्टेज के इस्तेमाल करलऽ गेलऽ छेलै । कथित पुर्किन्जे कोशिका केरऽ पहचान (i) शरीर केरऽ आकार, (ii) सेरिबैलम केरऽ शारीरिक स्थान, आरू (iii) फ्लोरोसेंट mtYFP रिपोर्टर जीन केरऽ अभिव्यक्ति द्वारा करलऽ गेलऽ छेलै । 5 स॑ 11 मेगोहम के टिप प्रतिरोध वाला पैच पिपेट क॑ बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका (जीबी१५०-१०, ०.८६ मिमी×१.५ मिमी×१०० मिमी, साइंस प्रोडक्ट्स, होफहेम, जर्मनी) आरू क्षैतिज पिपेट इंस्ट्रूमेंट्स (पी-१०००, सटर), नोवाटो, सीए द्वारा बाहर निकाललऽ जाय छै । सब रिकॉर्डिंग ELC-03XS npi पैच क्लैंप एम्पलीफायर (npi electronic GmbH, Tam, Germany) द्वारा करलौ गेलौ छेलै, जेकरा सॉफ्टवेयर सिग्नल (संस्करण 6.0, कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक, कैम्ब्रिज, यूके) द्वारा नियंत्रित करलौ गेलौ छेलै । प्रयोग क॑ 12.5 किलोहर्ट्ज के नमूना दर प॑ रिकॉर्ड करलऽ गेलऽ छेलै । सिग्नल क॑ दू शॉर्ट-पास बेसल फिल्टर स॑ फिल्टर करलऽ जाय छै जेकरऽ कटऑफ फ्रीक्वेंसी क्रमशः १.३ आरू १० किलोहर्ट्ज छै । झिल्ली आरू पिपेट केरऽ समाई क॑ एम्पलीफायर के उपयोग करी क॑ कम्पेंसेशन सर्किट द्वारा क्षतिपूर्ति करलऽ जाय छै । सब प्रयोग ऑर्का-फ्लैश 4.0 कैमरा (हमामात्सु, गेर्डन, जर्मनी) के नियंत्रण में करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा होकावो सॉफ्टवेयर (संस्करण 2.8, हमामात्सु, गेर्डन, जर्मनी) द्वारा नियंत्रित करलऽ गेलऽ छेलै ।
नियमित सम्पूर्ण कोशिका विन्यास एवं विश्लेषण। रिकॉर्डिंग सं ठीक पहिले, पिपेट कें आंतरिक घोल सं भरूं, जेकरा मे निम्नलिखित पदार्थ होयत छै: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM पोटेशियम ग्लूकोनेट, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) आ 10.0 mM क्रिएटिनिन फॉस्फेट क॑ पीएच 7.25 तलक समायोजित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू आसमाटिक दबाव 290 mOsm (सुक्रोज) छेलै । झिल्ली क॑ फाड़ै लेली 0 पीए केरऽ बल लगाबै के तुरंत बाद आराम करलऽ गेलऽ झिल्ली केरऽ विभव क॑ मापलऽ गेलै । इनपुट प्रतिरोध क॑ -40, -30, -20, आरू -10 pA केरऽ हाइपरपोलराइज्ड करंट लगाय क॑ मापलऽ जाय छै । वोल्टेज प्रतिक्रिया केरऽ परिमाण क॑ मापी क॑ इनपुट प्रतिरोध केरऽ गणना करै लेली ओम केरऽ नियम के प्रयोग करलऽ जाय । स्वतःस्फूर्त गतिविधि क॑ 5 मिनट तलक वोल्टेज क्लैंप म॑ रिकॉर्ड करलऽ गेलऽ छेलै, आरू अर्ध-स्वचालित पहचान स्क्रिप्ट के उपयोग करी क॑ इगोर प्रो (संस्करण 32 7.01, वेवमेट्रिक्स, लेक ओस्वेगो, ओरेगन, अमेरिका) म॑ एसपीएससी के पहचान आरू मापन करलऽ गेलऽ छेलै । आईवी वक्र आरू स्थिर-स्थिति करंट क॑ बैटरी क॑ अलग-अलग पोटेंशियल (-110 एमवी स॑ शुरू) प॑ क्लैंप करी क॑ आरू 5 एमवी स्टेप म॑ वोल्टेज बढ़ा क॑ मापलऽ जाय छै । एपी केरऽ उत्पादन केरऽ परीक्षण डिपोलराइजिंग करंट लगाय क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । डिपोलराइजिंग करंट पल्स लगाबैत काल -70 एमवी पर कोशिका कें क्लैंप करूं. प्रत्येक रिकॉर्डिंग यूनिट कें स्टेप साइज कें अलग-अलग (10 सं 60 पीए) समायोजित करूं. पल्स स्पाइक कें मैन्युअल रूप सं गिनती करयत अधिकतम एपी आवृत्ति कें गणना करूं जे सब सं बेसि एपी आवृत्ति कें कारण बनय छै. एपी थ्रेशोल्ड के विश्लेषण विध्रुवीकरण पल्स केरऽ दोसरऽ व्युत्पन्न के उपयोग करी क॑ करलऽ जाय छै जे सबसें पहलऽ एक या एक स॑ अधिक एपी क॑ ट्रिगर करै छै ।
छिद्रित पैच विन्यास एवं विश्लेषण। मानक प्रोटोकॉल कें उपयोग करयत छिद्रित पैच रिकॉर्डिंग करूं. एटीपी- आ जीटीपी-मुक्त पिपेट कें उपयोग करूं जेकरा मे निम्नलिखित सामग्री नहि होयत छै: 128 एमएम ग्लूकोनेट के, 10 एमएम केसीएल, 10 एमएम हेपेस, 0.1 एमएम ईजीटीए आ 2 एमएम एमजीसीएल2, आ पीएच 7.2 (केओएच कें उपयोग करयत) पर समायोजित करूं. कोशिका झिल्ली केरऽ अनियंत्रित पारगम्यता क॑ रोकै लेली अंतःकोशिकीय घोल स॑ एटीपी आरू जीटीपी छोड़लऽ जाय छै । पैच पिपेट कें एम्फोटेरिसिन युक्त आंतरिक घोल (लगभग 200 सं 250μg/ml; G4888, सिग्मा-एल्ड्रिच) सं भरल जायत छै, ताकि एकटा पंच पैच रिकॉर्ड प्राप्त कैल जा सकय. एम्फोटेरिसिन क॑ डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (अंतिम सांद्रता: 0.1 स॑ 0.3%; डीएमएसओ; डी8418, सिग्मा-एल्ड्रिच) म॑ घोललऽ गेलऽ छेलै । उपयोग करलौ गेलौ डीएमएसओ केरौ एकाग्रता के अध्ययन करलौ गेलौ न्यूरॉन्स प कोनो खास प्रभाव नै पड़लै । पंचिंग प्रक्रिया के दौरान चैनल प्रतिरोध (Ra) के लगातार निगरानी करलऽ गेलै, आरू Ra आरू AP के आयाम स्थिर होय के बाद (20-40 मिनट) प्रयोग शुरू करलऽ गेलै । स्वतःस्फूर्त गतिविधि कें वोल्टेज आ/अथवा करंट क्लैंप मे 2 सं 5 मिनट कें लेल मापल जायत छै. डाटा विश्लेषण इगोर प्रो (संस्करण 7.05.2, वेवमेट्रिक्स, अमेरिका), एक्सेल (संस्करण 2010, माइक्रोसॉफ्ट कॉर्पोरेशन, रेडमंड, अमेरिका) आरू ग्राफपैड प्रिज्म (संस्करण 8.1.2, ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, ला जोला, सीए) कें उपयोग सं करल गेलय छेलै. संयुक्त राज्य अमेरिका)। सहज एपी कें पहचान करय कें लेल इगोरप्रो कें न्यूरोमैटिक v3.0c प्लग-इन कें उपयोग करल जाय छै. कोनों देल गेल थ्रेशोल्ड कें उपयोग करयत एपी कें स्वचालित रूप सं पहचान करनाय, जे प्रत्येक रिकॉर्ड कें लेल अलग-अलग समायोजित कैल जायत छै. स्पाइक अंतराल के उपयोग करी क॑ अधिकतम तात्कालिक स्पाइक आवृत्ति आरू औसत स्पाइक आवृत्ति के साथ स्पाइक आवृत्ति निर्धारित करलऽ जाय ।
पीएन अलगाव। पहिने प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुकूल होय क॑, पीएन क॑ एक निर्दिष्ट चरण ( 58 ) प॑ माउस सेरिबैलम स॑ शुद्ध करलऽ गेलऽ छेलै । संक्षेप म॑, सेरिबैलम क॑ विच्छेदित करी क॑ बर्फ-ठंडा विच्छेदन माध्यम म॑ कीमा करलऽ गेलऽ छेलै [बिना HBSS Ca2+ आरू Mg2+ के, 20 mM ग्लूकोज, पेनिसिलिन (50 U/ml) आरू स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.05 mg/ ml) स॑ पूरक करलऽ गेलऽ छेलै], आरू ओकरा बाद माध्यम क॑ पपेन [HBSS, 1-cysteine·HCl स॑ पूरक करलऽ गेलऽ छेलै (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर), पपेन (16 यू / मिलीलीटर) आ डिऑक्सीराइबोन्यूक्लियस I (डीएनएज I; 0.1 मिलीग्राम/एमएल)] 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तक इलाज करू। पहिने ऊतकक कें कमरा कें तापमान पर अंडा कें बलगम (10 मिलीग्राम/एमएल), बीएसए (10 मिलीग्राम/एमएल) आ डीएनएज (0.1 मिलीग्राम/एमएल) युक्त एचबीएसएस माध्यम मे धोऊं ताकि एंजाइमी पाचन कें रोकल जा सकय, आ फेर 20 एमएम ग्लूकोज युक्त एचबीएसएस माध्यम मे एचबीएसएस, पेनिसिलिन (50 यू/एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.05 मिलीग्राम/एमएल) आ धीरे सं पीसनाय डीएनएज (0.1 मिलीग्राम/एमएल) एकल कोशिका छोड़ैत अछि। परिणामस्वरूप कोशिका निलंबन क॑ 70μm कोशिका छना के माध्यम स॑ छानलऽ गेलऽ छेलै, तखनिये कोशिका क॑ अपकेंद्रित्रण (1110 आरपीएम, 5 मिनट, 4°C) द्वारा गोली बनालऽ गेलऽ छेलै आरू छँटाई माध्यम [HBSS, 20 mM ग्लूकोज, 20% भ्रूण गोजातीय ) सीरम, पेनिसिलिन (50 U/ml) आरू स्ट्रेप्टोमाइसिन स॑ पूरक करलऽ गेलऽ छेलै (0.05 मिलीग्राम / मिलीलीटर)]; प्रोपिडियम आयोडाइड कें साथ कोशिका व्यवहार्यता कें मूल्यांकन करनाय आ कोशिका घनत्व कें 1×106 सं 2×106 कोशिका/एमएल कें लेल समायोजित करनाय. फ्लो साइटोमेट्री स॑ पहल॑ निलंबन क॑ 50 माइक्रोन सेल छना के माध्यम स॑ छानलऽ गेलऽ छेलै ।
प्रवाह कोशिकामापी। कोशिका छँटाई क॑ 4°C प॑ FACSAria III मशीन (बीडी बायोसाइंसेज) आरू एफएसीएसडीवा सॉफ्टवेयर (बीडी बायोसाइंसेज, संस्करण 8.0.1) के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । कोशिका निलंबन क॑ ~2800 घटना/सेकंड के दर स॑ 20 पीएसआई के दबाव म॑ 100 माइक्रोन नोजल के उपयोग करी क॑ छाँटलऽ गेलऽ छेलै । चूँकि पारंपरिक गेटिंग मानदंड (कोशिका आकार, द्विधा भेदभाव, आरू बिखरऽ के विशेषता) अन्य कोशिका प्रकारऽ स॑ पीएन केरऽ सही अलगाव सुनिश्चित नै करी सकै छै, गेटिंग रणनीति क॑ mitoYFP+ ​​आरू नियंत्रण mitoYFP − चूहऽ म॑ YFP तीव्रता आरू ऑटोफ्लोरोसेंस केरऽ सीधा तुलना के आधार प॑ सेट करलऽ जाय छै । वाईएफपी क॑ नमूना क॑ ४८८ एनएम लेजर लाइन स॑ विकिरण करी क॑ उत्तेजित करलऽ जाय छै, आरू सिग्नल क॑ ५३०/३० एनएम बैंड पास फिल्टर के उपयोग करी क॑ पता लगाय देलऽ जाय छै । mitoYFP+ ​​चूहों म॑ Rosa26-mitoYFP रिपोर्टर जीन केरऽ सापेक्षिक ताकत के उपयोग न्यूरॉनल बॉडी आरू एक्सोन टुकड़ा क॑ अलग करै लेली भी करलऽ जाय छै । 7-एएडी क॑ 561 एनएम पीला लेजर स॑ उत्तेजित करलऽ जाय छै आरू 675/20 एनएम बैंडपास फिल्टर स॑ पता लगाय क॑ मृत कोशिका क॑ बाहर करलऽ जाय छै । एक ही समय म॑ एस्ट्रोसाइट्स क॑ अलग करै लेली कोशिका निलंबन क॑ एसीएसए-२-एपीसी स॑ रंगलऽ गेलै, तभिये नमूना क॑ ६४० एनएम लेजर लाइन स॑ विकिरणित करलऽ गेलै, आरू सिग्नल के पता लगाबै लेली ६६०/२० एनएम बैंडपास फिल्टर के इस्तेमाल करलऽ गेलै ।
एकत्रित कोशिका क॑ अपकेंद्रित्रण (1110 आरपीएम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा गोली बनालऽ गेलऽ छेलै आरू उपयोग तलक -80 डिग्री सेल्सियस प॑ संग्रहित करलऽ गेलऽ छेलै । Mfn2cKO चूहों आ ओकर कूड़ा पिल्लाक कें एकहि दिन वर्गीकृत कैल जायत छै, ताकि प्रक्रियात्मक परिवर्तनशीलता कें न्यूनतम कैल जा सकएय. एफएसीएस डाटा प्रस्तुति आरू विश्लेषण फ्लोजो सॉफ्टवेयर (फ्लोजो एलएलसी, एशलैंड, ओरेगन, अमेरिका) कें उपयोग सं करल गेलय छेलै.
जैना कि ऊपर कहलऽ गेलऽ छै (59), रियल-टाइम पीसीआर के उपयोग बाद के mtDNA मात्रा निर्धारण लेली छंटनी करलऽ गेलऽ न्यूरॉन्स स॑ डीएनए क॑ अलग करै लेली करलऽ जाय छै । रैखिकता आरू थ्रेशोल्ड संवेदनशीलता केरऽ परीक्षण शुरू म॑ अलग-अलग संख्या म॑ कोशिका प॑ qPCR चलाबै स॑ करलऽ गेलऽ छेलै । संक्षेप मे, 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.5), 1 एमएम ईडीटीए, 0.5% ट्वीन 20 आ प्रोटीनेज के (200 एनजी/एमएल) सं मिलय वाला लाइसिस बफर मे 300 पीएन एकत्रित करू आ 55 डिग्री सेल्सियस पर 120 मिनट धरि इन्क्यूबेट करू. कोशिका क॑ आरू 95 डिग्री सेल्सियस प॑ 10 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै ताकि प्रोटीनेज के केरऽ पूर्ण निष्क्रियता सुनिश्चित करलऽ जाय सक॑ ।mt-Nd1 लेली विशिष्ट TaqMan जांच (थर्मो फिशर) के उपयोग करी क॑ mtDNA क॑ 7900HT रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर साइंटिफिक) म॑ अर्ध-मात्रा पीसीआर द्वारा मापलऽ गेलऽ छेलै । विज्ञान, कैटलॉग नंबर Mm04225274_s1), mt-Nd6 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर AIVI3E8) आरू 18S (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर Hs99999901_s1) जीन ।
प्रोटीओम नमूना तैयारी। घोल क॑ 95 डिग्री सेल्सियस प॑ 10 मिनट तलक गरम करी क॑ आरू सोनिकेशन करी क॑, लाइसिस बफर म॑ [6 एम गुआनिडिन क्लोराइड, 10 एमएम ट्राइस (2-कार्बोक्जिएथिल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड, 10 एमएम क्लोरोएसीटामाइड आरू 100 एमएम ट्राइस- एचसीएल म॑ लाइज जमे हुए न्यूरॉन गोलियां] । बायोरप्टर (डायजेनोड) पर 10 मिनट (30 सेकंड पल्स / 30 सेकंड के विराम अवधि) तक | नमूना क॑ 20 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) म॑ 1:10 पतला करी क॑ 300 एनजी ट्रिप्सिन गोल्ड (प्रोमेगा) स॑ मिला क॑ 37 डिग्री सेल्सियस प॑ रात भर इन्क्यूबेशन करी क॑ पूरा पाचन प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै । दोसर दिन नमूना कए 20,000 ग्राम पर 20 मिनट तक अपकेंद्रित्रित कैल गेल। सुपरनेटेंट क॑ 0.1% फॉर्मिक एसिड स॑ पतला करलऽ गेलऽ छेलै, आरू घोल क॑ स्वनिर्मित स्टेजटिप्स स॑ नमक मुक्त करलऽ गेलऽ छेलै । नमूना क॑ स्पीडवैक इंस्ट्रूमेंट (एपेनडॉर्फ कंसेन्ट्रेटर प्लस ५३०५) म॑ ४५ डिग्री सेल्सियस प॑ सुखायलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद पेप्टाइड क॑ ०.१% फॉर्मिक एसिड म॑ निलंबित करलऽ गेलऽ छेलै । सब नमूना एकहि व्यक्ति द्वारा एकहि संग तैयार कयल गेल। एस्ट्रोसाइट नमूना के विश्लेषण के क्रम म॑ 4 μg डिसाल्टेड पेप्टाइड क॑ टैंडम मास टैग (TMT10plex, कैटलॉग नंबर 90110, थर्मो फिशर साइंटिफिक) स॑ लेबल करलऽ गेलऽ छेलै जेकरऽ पेप्टाइड आरू टीएमटी अभिकर्मक अनुपात 1:20 छेलै । टीएमटी लेबलिंग के लेल, 0.8 मिलीग्राम टीएमटी अभिकर्मक क॑ 70 μl निर्जल एसीएन म॑ पुनः निलंबित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू सूखलऽ पेप्टाइड क॑ 9 μl 0.1 एम टीईएबी (ट्राइएथिल अमोनियम बाइकार्बोनेट) म॑ पुनर्गठित करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा म॑ एसीएन म॑ 7 μl टीएमटी अभिकर्मक मिलालऽ गेलऽ छेलै । एकर एकाग्रता 43.75% छल। 60 मिनट के ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया क॑ 2 μl 5% हाइड्रोक्सिलामाइन स॑ बुझाय देलऽ गेलै । लेबल पेप्टाइड क॑ एकत्रित करी क॑ सुखाय क॑ 0.1% फॉर्मिक एसिड (एफए) केरऽ 200μl म॑ पुनः निलंबित करी क॑ दू भाग म॑ विभाजित करी क॑, आरू ओकरा बाद स्व-निर्मित स्टेजटिप्स के उपयोग करी क॑ नमक मुक्त करी देलऽ गेलै । अल्टीमेट 3000 अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ (अल्टीमेट 3000 अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ) के उपयोग करी क॑ दू आधा म॑ स॑ एक क॑ 130Å1.7μm C18 कण (वाटर्स, कैटलॉग नंबर SKU: 186006935) स॑ भरलऽ 1mm x 150mm एक्क्विटी क्रोमैटोग्राफिक कॉलम प॑ विभाजित करलऽ गेलऽ छेलै । थर्मो फिशर वैज्ञानिक)। 30μl/मिनट कें प्रवाह दर सं पेप्टाइड कें अलग करूं, 96 मिनट कें चरणबद्ध ढाल कें साथ 85 मिनट कें लेल 1% सं 50% बफर बी कें अलग करूं, 50% सं 95% बफर बी कें 3 मिनट कें लेल, फेर 95 % बफर बी कें लेल 8 मिनट; बफर ए 5% एसीएन आ 10 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट (एबीसी) छै, आ बफर बी 80% एसीएन आ 10 एमएम एबीसी छै. हर 3 मिनट पर अंश एकत्रित क दू समूह (1 + 17, 2 + 18, आदि) मे मिला कए वैक्यूम अपकेंद्रित्र मे सुखाउ ।
एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लेलऽ पेप्टाइड (नंबर r119.aq) क॑ 25 सेमी, 75 माइक्रोन भीतरी व्यास वाला पिकोफ्रिट विश्लेषणात्मक कॉलम (नया उद्देश्य लेंस, भाग संख्या PF7508250) प॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै जे 1.9 माइक्रोन रिप्रोसिल-पुर 120 सी18-एक्यू माध्यम (डॉ. मैश, मैट) स॑ लैस छेलै, ईएएसवाई-एनएलसी के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै 1200 (थर्मो फिशर वैज्ञानिक, जर्मनी)। स्तंभ 50 डिग्री सेल्सियस पर रखल गेल। बफर ए आ बी क्रमशः 0.1% फॉर्मिक एसिड आ 80% एसीएन मे 0.1% फॉर्मिक एसिड छै. पेप्टाइड क॑ 65 मिनट तलक 6% स॑ 31% बफर बी आरू 5 मिनट तलक 31% स॑ 50% बफर बी तलक 200 एनएल/मिनट के ढाल के साथ अलग करलऽ गेलऽ छेलै । इल्यूट करलऽ गेलऽ पेप्टाइडऽ के विश्लेषण ऑर्बिट्रैप फ्यूजन मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) प॑ करलऽ गेलऽ छेलै । पेप्टाइड पूर्ववर्ती m/z मापन 350 स॑ 1500 m/z के रेंज म॑ 120,000 के रिजोल्यूशन के साथ करलऽ जाय छै । 27% सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा के उपयोग करी क॑ 2 स॑ 6 के चार्ज अवस्था वाला सबसें मजबूत पूर्ववर्ती क॑ उच्च ऊर्जा सी ट्रैप डिसोसिएशन (HCD) विच्छेदन लेली चुनलऽ जाय छै । चक्र समय 1 s पर सेट कएल गेल अछि। पेप्टाइड टुकड़ा केरऽ m/z मान क॑ आयन ट्रैप म॑ 5×104 केरऽ सबसें छोटऽ एजीसी लक्ष्य आरू अधिकतम इंजेक्शन समय 86 एमएस के उपयोग करी क॑ मापलऽ गेलऽ छेलै । विखंडन के बाद पूर्ववर्ती क॑ 45 s तलक गतिशील बहिष्कार सूची म॑ रखलऽ गेलऽ छेलै । टीएमटी-लेबल पेप्टाइड क॑ 50 सेमी, 75 माइक्रोन केरऽ एक्लेम पेपमैप कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर 164942) प॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै, आरू माइग्रेशन स्पेक्ट्रा क॑ उच्च क्षेत्र असममित तरंगरूप आयन (एफएआईएमएस) उपकरण स॑ लैस ऑर्बिट्रैप लुमोस ट्राइब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) प॑ विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै (थर्मो फिशर साइंटिफिक) −50 आरू −70 वी के दू मुआवजा वोल्टेज प॑ काम करै छै.सिंक्रनाइजेशन पूर्ववर्ती के आधार प॑ चुनलऽ गेलऽ एमएस3 क॑ टीएमटी रिपोर्ट आयन सिग्नल मापन लेली प्रयोग करलऽ जाय छै. पेप्टाइड पृथक्करण क॑ EASY-nLC 1200 प॑ करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा म॑ 90% रैखिक ढाल इल्यूशन के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरऽ बफर सांद्रता 6% स॑ 31% छेलै; बफर ए 0.1% एफए, आ बफर बी 0.1% एफए आ 80% एसीएन छल। विश्लेषणात्मक स्तंभ 50 डिग्री सेल्सियस पर संचालित होयत छै. FAIMS मुआवजा वोल्टेज कें अनुसार मूल फाइल कें विभाजित करय कें लेल FreeStyle (संस्करण 1.6, Thermo Fisher Scientific) कें उपयोग करूं.
प्रोटीन पहचान एवं मात्रा निर्धारण। एकीकृत एंड्रोमेडा सर्च इंजन के उपयोग करी क॑ मूल आंकड़ऽ के विश्लेषण मैक्सक्वांट संस्करण १.५.२.८ (https://maxquant.org/) के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । Aequorea victoria स॑ प्राप्त Cre recombinase आरू YFP अनुक्रम के अलावा, पेप्टाइड टुकड़ा स्पेक्ट्रा क॑ माउस संदर्भ प्रोटीओम (Proteome ID UP000000589, मई 2017 म॑ UniProt स॑ डाउनलोड करलऽ गेलऽ) केरऽ कैनोनिकल अनुक्रम आरू आइसोफॉर्म अनुक्रम के खोज करलऽ गेलऽ छेलै । मेथियोनिन ऑक्सीकरण आरू प्रोटीन एन-टर्मिनल एसिटाइलेशन क॑ चर संशोधन के रूप म॑ सेट करलऽ गेलऽ छेलै; सिस्टीन कार्बामोइल मिथाइलेशन क॑ निश्चित संशोधन के रूप म॑ सेट करलऽ गेलऽ छेलै । पाचन पैरामीटर “विशिष्टता” आ “ट्रिप्सिन/पी” पर सेट कैल गेल छै. प्रोटीन पहचान कें लेल उपयोग कैल जाय वाला पेप्टाइड आ रेजर पेप्टाइड कें न्यूनतम संख्या 1 छै; अद्वितीय पेप्टाइड केरऽ न्यूनतम संख्या 0. पेप्टाइड मैप मिलान केरऽ शर्तऽ के तहत प्रोटीन पहचान दर 0.01 छेलै । “सेकेंड पेप्टाइड” विकल्प सक्षम अछि | विभिन्न मूल फाइल कें बीच सफल पहचान कें स्थानांतरित करय कें लेल “रन कें बीच मिलान” विकल्प कें उपयोग करूं. लेबल-मुक्त मात्रा निर्धारण (एलएफक्यू) (60) कें लेल एलएफक्यू न्यूनतम अनुपात गिनती 1 कें उपयोग करूं. एलएफक्यू तीव्रता क॑ हर समय बिंदु प॑ कम स॑ कम एक जीनोटाइप समूह म॑ कम स॑ कम दू वैध मानऽ लेली छानलऽ जाय छै, आरू एकरऽ चौड़ाई वाला सामान्य वितरण स॑ एक्सट्रैपोलेट करलऽ जाय छै । 0.3 आ नीचाँ 1.8। एलएफक्यू परिणामक कें विश्लेषण करय कें लेल पर्सियस कंप्यूटिंग प्लेटफॉर्म (https://maxquant.net/perseus/) आ आर (https://r-project.org/) कें उपयोग करूं. लिम्मा सॉफ्टवेयर पैकेज स॑ एक द्वि-तरफा मध्यम टी परीक्षण केरऽ उपयोग विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण ( 61 ) के लेलऽ करलऽ गेलऽ छेलै । अन्वेषणात्मक डाटा विश्लेषण ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally आ pheatmap कें उपयोग सं कैल जायत छै. टीएमटी आधारित प्रोटीओमिक्स डाटा कें विश्लेषण मैक्सक्वांट संस्करण 1.6.10.43 कें उपयोग सं करल गेलय छेलै. यूनिप्रोट केरऽ मानव प्रोटीओमिक्स डाटाबेस स॑ कच्चा प्रोटीओमिक्स डाटा के खोज करऽ, जेकरा सितंबर २०१८ म॑ डाउनलोड करलऽ गेलऽ छेलै ।विश्लेषण म॑ निर्माता द्वारा उपलब्ध कराय देलऽ गेलऽ आइसोटोप शुद्धता सुधार कारक शामिल छै । विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिये आर में लिम्मा का प्रयोग करे | मूल डाटा, डाटाबेस खोज परिणाम, आ डाटा विश्लेषण कार्यप्रवाह आ परिणाम सबटा डाटा सेट पहचानकर्ता PXD019690 कें साथ PRIDE भागीदार भंडार कें माध्यम सं ProteomeXchange गठबंधन मे संग्रहीत कैल जायत छै.
कार्यात्मक एनोटेशन विश्लेषण के समृद्ध करैत अछि। 8 सप्ताह (चित्र 1) पर सेट करल गेलय डाटा कें कार्यात्मक एनोटेशन पदक कें समृद्धि कें निर्धारित करय कें लेल चातुर्य मार्ग विश्लेषण (QIAGEN) उपकरण कें उपयोग करल गेलय छेलै. संक्षेप म॑, एलसी-एमएस/एमएस (टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री) डाटा विश्लेषण स॑ प्राप्त मात्रात्मक प्रोटीन सूची के उपयोग निम्नलिखित फिल्टर मानदंड के साथ करलऽ जाय छै: मस मस्कुलस क॑ प्रजाति आरू पृष्ठभूमि के रूप म॑ चुनलऽ जाय छै, आरू श्रेणी संवर्धन 0.05 या ओकरा स॑ कम के लेलऽ बेंजामिन द्वारा समायोजित पी मान क॑ महत्वपूर्ण मानलऽ जाय छै । अइ ग्राफ कें लेल समायोजित पी मान कें आधार पर प्रत्येक समूह मे शीर्ष पांच अतिरिक्त श्रेणीक कें दर्शाओल गेल छै. मल्टीपल टी-टेस्ट के उपयोग करी क॑, बेंजामिन, क्रिएगर, आरू येकुतिएली (क्यू = 5%) केरऽ दू-चरणीय रैखिक बूस्ट प्रोग्राम के उपयोग करी क॑, हर श्रेणी म॑ पहचानलऽ गेलऽ महत्वपूर्ण उम्मीदवारऽ प॑ समय-कोर्स प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करलऽ जाय छै, आरू हर पंक्ति क॑ अलग-अलग विश्लेषण करलऽ जाय छै । सुसंगत एसडी अपनाबय के कोनो जरूरत नहिं.
प्रकाशित डाटाबेस के साथ ई अध्ययन के परिणाम के तुलना करै आरू चित्र 1 म॑ वेन आरेख उत्पन्न करै के क्रम म॑, हमन॑ मात्रात्मक प्रोटीन सूची क॑ माइटोकार्टा 2.0 एनोटेशन (24) के साथ जोड़लकै । आरेख उत्पन्न करय कें लेल ऑनलाइन उपकरण Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) कें उपयोग करूं.
प्रोटीओमिक्स विश्लेषण कें लेल उपयोग कैल जाय वाला सांख्यिकीय प्रक्रियाक कें विस्तृत जानकारी कें लेल, कृपया सामग्री आ विधियक कें संबंधित खंड कें देखूं. अन्य सब प्रयोग के लेलऽ विस्तृत जानकारी संबंधित किंवदंती म॑ मिल॑ सकै छै । जब तलक अन्यथा निर्दिष्ट नै करलऽ गेलऽ छै, सब आँकड़ा औसत ± एसईएम के रूप म॑ व्यक्त करलऽ गेलऽ छै, आरू सब सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 8.1.2 सॉफ्टवेयर के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै ।
एहि लेख के लेल पूरक सामग्री के लेल कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 देखू
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एहि प्रश्नक उपयोग ई परीक्षण करबाक लेल कएल जाइत अछि जे अहाँ विजिटर छी वा नहि आ स्वचालित स्पैम जमा करबा सँ रोकल जाइत अछि ।
ई मोटोरी, आई अटानासोव, एसएमवी कोचन, के फोल्ज-डोनाहुए, वी सक्तिवेलु, पी जियावालिस्को, एन टोनी, जे पुयाल, एन-जी द्वारा। लार्सन
बेकाम न्यूरॉन्स के प्रोटीओमिक्स विश्लेषण स॑ पता चललै कि न्यूरोडिजनरेशन के मुकाबला करै लेली मेटाबोलिक प्रोग्राम सक्रिय होय जाय छै ।
ई मोटोरी, आई अटानासोव, एसएमवी कोचन, के फोल्ज-डोनाहुए, वी सक्तिवेलु, पी जियावालिस्को, एन टोनी, जे पुयाल, एन-जी द्वारा। लार्सन
बेकाम न्यूरॉन्स के प्रोटीओमिक्स विश्लेषण स॑ पता चललै कि न्यूरोडिजनरेशन के मुकाबला करै लेली मेटाबोलिक प्रोग्राम सक्रिय होय जाय छै ।
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