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प्रोपिओनिक एसिड (PPA) के उपयोग ऑटिज्म स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर जैसनऽ न्यूरोडेवलपमेंटल डिसऑर्डर म॑ माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन के भूमिका के अध्ययन लेली करलऽ जाय छै । पीपीए माइटोकॉन्ड्रिया जैवजनन, चयापचय, आ कारोबार कें बाधित करय कें लेल जानल जायत छै. लेकिन, ई तंत्र केरऽ जटिल टेम्पोरल प्रकृति के कारण माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता, विखंडन आरू संलयन प॑ पीपीए केरऽ प्रभाव समस्याग्रस्त बनलऽ छै । यहाँ, हम पूरक मात्रात्मक इमेजिंग तकनीक के उपयोग ई जांच करै लेली करै छै कि पीपीए न्यूरॉन जैसनऽ SH-SY5Y कोशिका म॑ माइटोकॉन्ड्रिया अल्ट्रास्ट्रक्चर, आकृति विज्ञान, आरू गतिशीलता क॑ कोना प्रभावित करै छै । पीपीए (5 एमएम) न॑ माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्र (पी <0.01), फेरेट व्यास आरू परिधि (पी <0.05), आरू क्षेत्र 2 (पी <0.01) म॑ काफी कमी के कारण बनलै । माइटोकॉन्ड्रिया घटना लोकेटर विश्लेषण न॑ विखंडन आरू संलयन घटना म॑ काफी वृद्धि (p < 0.05) देखैलकै, जेकरा स॑ तनाव केरऽ परिस्थिति म॑ माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क केरऽ अखंडता बनलऽ रहै । एकरऽ अलावा, cMYC (पी <0.0001), NRF1 (पी <0.01), TFAM (पी <0.05), STOML2 (पी <0.0001) आरू OPA1 (पी <0.05) केरऽ mRNA अभिव्यक्ति म॑ काफी कमी आबी गेलऽ छेलै । 01)। ई तनाव केरऽ परिस्थिति म॑ कार्य क॑ बनाए रखै लेली माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान, जैवजनन आरू गतिशीलता केरऽ पुनर्निर्माण क॑ दर्शाबै छै । हमरऽ आंकड़ा माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता प॑ पीपीए केरऽ प्रभाव के बारे म॑ नया जानकारी प्रदान करै छै आरू माइटोकॉन्ड्रिया तनाव प्रतिक्रिया म॑ शामिल जटिल नियामक तंत्र के अध्ययन लेली इमेजिंग तकनीक के उपयोगिता प॑ प्रकाश डालै छै ।
माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा उत्पादन आरू जैव संश्लेषण म॑ अपनऽ विशिष्ट भूमिका स॑ परे विभिन्न कोशिकीय कार्यऽ म॑ अभिन्न भागीदार छै । माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय कैल्शियम संकेत, चयापचय आ रेडॉक्स होमियोस्टेसिस, भड़काऊ संकेत, एपिजेनेटिक संशोधन, कोशिका प्रसार, भेदभाव आ प्रोग्रामेड कोशिका मृत्यु कें एकटा प्रमुख नियामक छै1. विशेष रूप स॑, माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय न्यूरॉनल विकास, जीवित रहना आरू कार्य लेली महत्वपूर्ण छै आरू न्यूरोपैथोलॉजी केरऽ विभिन्न अभिव्यक्ति म॑ व्यापक रूप स॑ शामिल छै2,3,4 ।
पिछला एक दशक मे मेटाबोलिक स्थिति न्यूरोजेनेसिस, भेदभाव, परिपक्वता आ प्लास्टिसिटी कें केंद्रीय नियामक कें रूप मे उभरल छै5,6. हाल ही म॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ आकृति विज्ञान आरू गतिशीलता माइटोसिस केरऽ विशेष रूप स॑ महत्वपूर्ण घटक बनी गेलऽ छै, जे एगो गतिशील प्रक्रिया छै जे कोशिका के भीतर स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ पूल क॑ बनाए रखै छै । माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता माइटोकॉन्ड्रिया जैवजनन आ जैव ऊर्जा विज्ञान सं ल क माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन, संलयन, परिवहन आ निकासी तक कें जटिल परस्पर निर्भर मार्गक द्वारा नियंत्रित कैल जायत छै7,8. एहि मे सं कोनो एकीकृत तंत्र के विघटन स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क के रखरखाव के बिगाड़ैत अछि आ न्यूरोडेवलपमेंट के लेल गहन कार्यात्मक परिणाम होइत अछि9,10. वास्तव में, माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता के विनियमन बहुत मनोरोग, न्यूरोडिजनरेटिव आ न्यूरोडेवलपमेंटल विकार में देखल जाइत अछि, जाहि में ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकार (ASD)11,12 सेहो शामिल अछि ।
एएसडी एकटा विषम न्यूरोडेवलपमेंटल डिसऑर्डर छै जेकरऽ जटिल आनुवंशिक आरू एपिजेनेटिक आर्किटेक्चर छै । एएसडी केरऽ वंशानुगतता निर्विवाद छै, लेकिन एकरऽ अंतर्निहित आणविक एटियलजि केरऽ बारे म॑ बहुत कम जानकारी मिललऽ छै । पूर्व-नैदानिक ​​मॉडल, नैदानिक ​​अध्ययन, आरू बहु-ओमिक्स आणविक डाटासेट स॑ डाटा इकट्ठा करना एएसडी13,14 म॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार केरऽ बढ़तऽ सबूत प्रदान करै छै । हमनें पहिने एएसडी के मरीजऽ के एक समूह म॑ जीनोम-व्यापी डीएनए मिथाइलेशन स्क्रीन करलकै आरू माइटोकॉन्ड्रिया मेटाबोलिक मार्ग के साथ समूहीकृत विभेदक रूप स॑ मिथाइल जीन के पहचान करलकै15 । बाद म॑ हमन॑ माइटोकॉन्ड्रिया जैवजनन आरू गतिशीलता केरऽ केंद्रीय नियामकऽ के विभेदक मिथाइलेशन के रिपोर्ट करलकै, जे एएसडी१६ म॑ बढ़लऽ mtDNA कॉपी संख्या आरू बदललऽ मूत्र चयापचय प्रोफाइल स॑ जुड़लऽ छेलै । हमरऽ आंकड़ा बढ़तऽ सबूत प्रदान करै छै कि माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता आरू होमियोस्टेसिस एएसडी केरऽ पैथोफिजियोलॉजी म॑ केंद्रीय भूमिका निभाबै छै । अतः माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता, आकृति विज्ञान, आरू कार्य के बीच संबंध के यंत्रवत् समझ म॑ सुधार करना माध्यमिक माइटोकॉन्ड्रिया विकार के विशेषता वाला न्यूरोलॉजिकल रोगऽ प॑ जारी शोध के एगो प्रमुख लक्ष्य छै ।
आणविक तकनीक के उपयोग अक्सर माइटोकॉन्ड्रिया तनाव प्रतिक्रिया म॑ विशिष्ट जीन के भूमिका के अध्ययन लेली करलऽ जाय छै । लेकिन, ई दृष्टिकोण माइटोटिक नियंत्रण तंत्र केरऽ बहुआयामी आरू कालगत प्रकृति के कारण सीमित होय सकै छै । एतबे नै, माइटोकॉन्ड्रिया जीन केरऽ विभेदक अभिव्यक्ति कार्यात्मक परिवर्तन केरऽ अप्रत्यक्ष सूचक छै, खास करी क॑ ई लेली कि आम तौर प॑ केवल सीमित संख्या म॑ जीन के विश्लेषण करलऽ जाय छै । अतः माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ कार्य आरू जैव ऊर्जा विज्ञान केरऽ अध्ययन लेली अधिक प्रत्यक्ष विधि प्रस्तावित करलऽ गेलऽ छै17 । माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता स॑ गहराई स॑ संबंधित छै । ऊर्जा उत्पादन आ माइटोकॉन्ड्रिया आ कोशिका जीवित रहय के लेल माइटोकॉन्ड्रिया के आकार, संपर्क, आ संरचना महत्वपूर्ण अछि5,18. एतबे नै, माइटोसिस केरऽ विभिन्न घटक माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान म॑ बदलाव प॑ केंद्रित छै, जे माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार केरऽ उपयोगी अंतिम बिंदु के रूप म॑ काम करी सकै छै आरू बाद के यंत्रवत् अध्ययन लेली आधार प्रदान करी सकै छै ।
माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान क॑ सीधा संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) के उपयोग करी क॑ देखलऽ जाब॑ सकै छै, जेकरा स॑ कोशिकीय अल्ट्रास्ट्रक्चर के विस्तृत अध्ययन के अनुमति मिलै छै । टीईएम सीधे व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के रिजोल्यूशन पर माइटोकॉन्ड्रिया क्रिस्टे के आकृति विज्ञान, आकार आरू संरचना के कल्पना करै छै, न कि केवल कोशिका आबादी म॑ जीन ट्रांसक्रिप्शन, प्रोटीन अभिव्यक्ति या माइटोकॉन्ड्रिया कार्यात्मक पैरामीटर प॑ भरोसा करै छै17,19,20. एकरऽ अलावा, टीईएम माइटोकॉन्ड्रिया आरू अन्य ऑर्गेनेल, जेना कि एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम आरू ऑटोफेगोसोम के बीच अंतःक्रिया के अध्ययन क॑ सुविधाजनक बनाबै छै, जे माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ कार्य आरू होमियोस्टेसिस म॑ प्रमुख भूमिका निभाबै छै21,22 । एहि तरहें, ई टीईएम क॑ विशिष्ट मार्ग या जीन प॑ ध्यान केंद्रित करै स॑ पहल॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार के अध्ययन लेली एगो अच्छा शुरुआती बिंदु बनाबै छै । जेना-जेना माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ कार्य न्यूरोपैथोलॉजी लेली तेजी स॑ प्रासंगिक होय रहलऽ छै, इन विट्रो न्यूरॉनल मॉडल म॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ आकृति विज्ञान आरू गतिशीलता के प्रत्यक्ष आरू मात्रात्मक अध्ययन करै म॑ सक्षम होय के स्पष्ट जरूरत छै ।
इस लेख म॑, हम ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकार म॑ माइटोकॉन्ड्रिया विकार केरऽ न्यूरॉनल मॉडल म॑ माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता के जांच करै छियै । हमनें पहलें माइटोकॉन्ड्रिया प्रोपिओनाइल-कोए कार्बोक्जिलेज एंजाइम पीसीसी केरऽ एगो सबयूनिट ASD15 म॑ प्रोपिओनाइल-कोए कार्बोक्जिलेज बीटा (पीसीसीबी) केरऽ विभेदक मिथाइलेशन केरऽ रिपोर्ट करल॑ छेलै । पीसीसी केरऽ विनियमन स॑ प्रोपिओनिक एसिड (पीपीए) सहित प्रोपिओनाइल डेरिवेटिव केरऽ विषाक्त संचय होय के कारण जानलऽ जाय छै २३,२४,२५ । पीपीए न्यूरॉनल मेटाबोलिज्म क॑ बाधित करै वाला आरू इन विवो म॑ व्यवहार म॑ बदलाव करै वाला दिखालऽ गेलऽ छै आरू ई एएसडी26,27,28 म॑ शामिल न्यूरोडेवलपमेंटल तंत्र के अध्ययन लेली एगो स्थापित जानवर मॉडल छै । एकरऽ अतिरिक्त, पीपीए क॑ इन विट्रो म॑ माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली केरऽ क्षमता, जैवजनन आरू श्वसन क॑ बाधित करै के रिपोर्ट करलऽ गेलऽ छै आरू एकरऽ व्यापक रूप स॑ उपयोग न्यूरॉन्स म॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार के मॉडलिंग लेली करलऽ गेलऽ छै29,30 । लेकिन, माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ आकृति विज्ञान आरू गतिशीलता प॑ पीपीए-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार केरऽ प्रभाव के बारे म॑ बहुत कम जानकारी मिललऽ छै ।
ई अध्ययन म॑ SH-SY5Y कोशिका म॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान, गतिशीलता, आरू कार्य प॑ पीपीए केरऽ प्रभाव क॑ मात्राबद्ध करै लेली पूरक इमेजिंग तकनीक के उपयोग करलऽ गेलऽ छै । सबसें पहलऽ, हमन॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान आरू अल्ट्रास्ट्रक्चर म॑ बदलाव के कल्पना करै लेली एगो टीईएम विधि विकसित करलकै17,31,32 । माइटोकॉन्ड्रिया33 केरऽ गतिशील प्रकृति क॑ देखत॑ हुअ॑ हमन॑ पीपीए तनाव के तहत विखंडन आरू संलयन घटना, माइटोकॉन्ड्रिया संख्या आरू आयतन के बीच संतुलन म॑ बदलाव के मात्रा निर्धारित करै लेली माइटोकॉन्ड्रिया इवेंट लोकलाइजर (एमईएल) विश्लेषण के भी इस्तेमाल करलकै । अंत में, हमनें ई जांच करलकै कि की माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान आरू गतिशीलता जैवजनन, विखंडन, आरू संलयन म॑ शामिल जीनऽ के अभिव्यक्ति म॑ बदलाव स॑ जुड़लऽ छै । एक साथ लेलऽ जाय त॑ हमरऽ आंकड़ा माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता क॑ नियंत्रित करै वाला तंत्र के जटिलता क॑ स्पष्ट करै के चुनौती क॑ दर्शाबै छै । हम SH-SY5Y कोशिकाओं म॑ माइटोसिस केरऽ मापनीय अभिसरण अंतिम बिंदु के रूप म॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान के अध्ययन म॑ TEM के उपयोगिता प॑ प्रकाश डालै छै । एकरऽ अतिरिक्त, हम ई बात प॑ प्रकाश डालै छियै कि टीईएम डाटा इमेजिंग तकनीक के साथ मिलाय क॑ सबसें समृद्ध जानकारी प्रदान करै छै जे चयापचय तनाव के प्रतिक्रिया म॑ गतिशील घटना क॑ भी कैप्चर करै छै । न्यूरॉनल कोशिका माइटोसिस के समर्थन करै वाला आणविक नियामक तंत्र के आरू विशेषता तंत्रिका तंत्र आरू न्यूरोडिजनरेटिव रोगऽ के माइटोकॉन्ड्रिया घटक के बारे म॑ महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करी सकै छै ।
माइटोकॉन्ड्रिया तनाव पैदा करै लेली, SH-SY5Y कोशिका क॑ 3 mM आरू 5 mM सोडियम प्रोपिओनेट (NaP) के उपयोग करी क॑ PPA स॑ उपचारित करलऽ गेलऽ छेलै । टीईएम स॑ पहल॑ नमूना क॑ उच्च दबाव वाला फ्रीजिंग आरू फ्रीजिंग (चित्र 1a) के उपयोग करी क॑ क्रायोजेनिक नमूना तैयारी के अधीन करलऽ गेलऽ छेलै । हमनें तीन जैविक प्रतिकृति भर म॑ माइटोकॉन्ड्रिया आबादी केरऽ आठ रूपात्मक पैरामीटर क॑ मापै लेली एगो स्वचालित माइटोकॉन्ड्रिया छवि विश्लेषण पाइपलाइन विकसित करलकै । हमनें पाया कि पीपीए उपचार न॑ चार पैरामीटर म॑ काफी बदलाव करलकै: क्षेत्र 2, क्षेत्र, परिधि, आरू फेरेट व्यास (चित्र 1b–e) । क्षेत्र 2 म॑ 3 एमएम आरू 5 एमएम पीपीए उपचार (क्रमशः पी = 0.0183 आरू पी = 0.002) दूनू के साथ काफी कमी आबी गेलऽ छै (चित्र 1b), जबकि क्षेत्र (पी = 0.003), परिधि (पी = 0.0106) आरू फेरेट व्यास सब म॑ काफी कमी आबी गेलऽ छै । नियंत्रण समूह (चित्र 1c–e) के तुलना म॑ 5 एमएम उपचार समूह म॑ काफी कमी (पी = 0.0172) देखलऽ गेलऽ छेलै । क्षेत्र आरू परिधि म॑ महत्वपूर्ण कमी स॑ पता चललै कि 5 एमएम पीपीए स॑ उपचारित कोशिका म॑ छोटऽ, अधिक गोल माइटोकॉन्ड्रिया छेलै, आरू ई माइटोकॉन्ड्रिया नियंत्रण कोशिका के तुलना म॑ कम लम्बा छेलै । ई फेरेट व्यास म॑ काफी कमी के साथ भी संगत छै, जे एगो स्वतंत्र पैरामीटर छै जे कणऽ के किनारी के बीच सबसें बड़ऽ दूरी म॑ कमी ​​के संकेत दै छै । क्रिस्टे केरऽ अल्ट्रास्ट्रक्चर म॑ बदलाव देखलऽ गेलै: पीपीए तनाव के प्रभाव म॑ क्रिस्टे कम स्पष्ट होय गेलै (चित्र 1a, पैनल बी) । लेकिन सब छवि क्रिस्टे केरऽ अल्ट्रास्ट्रक्चर क॑ स्पष्ट रूप स॑ नै दर्शाबै छेलै, ई लेली ई परिवर्तनऽ के मात्रात्मक विश्लेषण नै करलऽ गेलै । ई टीईएम डाटा तीन संभावित परिदृश्य क॑ दर्शाबै छै: (1) पीपीए विखंडन क॑ बढ़ाबै छै या संलयन क॑ रोकै छै, जेकरा स॑ मौजूदा माइटोकॉन्ड्रिया आकार म॑ सिकुड़ी जाय छै; (2) बढ़ल जैवजनन नव, छोट माइटोकॉन्ड्रिया के निर्माण करैत अछि या (3) दुनू तंत्र के एक संग प्रेरित करैत अछि | यद्यपि ई परिस्थिति क॑ टीईएम द्वारा भेद नै करलऽ जाब॑ सकै छै, लेकिन महत्वपूर्ण आकृति संबंधी परिवर्तन पीपीए तनाव के तहत माइटोकॉन्ड्रिया होमियोस्टेसिस आरू गतिशीलता म॑ बदलाव के संकेत दै छै । एकरऽ बाद हमनें ई गतिशीलता आरू एकरऽ अंतर्निहित संभावित तंत्र के आरू विशेषता के लेलऽ अतिरिक्त पैरामीटर के खोज करलकै ।
प्रोपिओनिक एसिड (PPA) माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान के पुनर्निर्माण करैत अछि | (क) प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) छवि जे दर्शाबै छै कि पीपीए उपचार बढ़ला के साथ माइटोकॉन्ड्रिया के आकार कम होय जाय छै आरू माइटोकॉन्ड्रिया छोट आरू गोल होय जाय छै; 0 मिमी (अउपचारित), 3 मिमी एवं 5 मिमी, क्रमशः। लाल तीर माइटोकॉन्ड्रिया के संकेत करैत अछि। (b–e) 24 घंटा तक पीपीए के साथ उपचारित SH-SY5Y कोशिकाओं क॑ TEM के लेलऽ तैयार करलऽ गेलऽ छेलै आरू परिणाम के विश्लेषण फिजी/ImageJ के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै । आठ पैरामीटर मे सं चारि मे नियंत्रण (अनउपचारित, 0 एमएम पीपीए) आ उपचारित (3 एमएम आ 5 एमएम पीपीए) कोशिका कें बीच महत्वपूर्ण अंतर देखल गेलय. (ख) क्षेत्र 2, (ग) क्षेत्रफल, (घ) परिधि, (ङ) फेरेट व्यास | महत्वपूर्ण अंतर (पी < 0.05) कें निर्धारण कें लेल विचरण कें एकतरफा विश्लेषण (नियंत्रण बनाम उपचार) आ डनेट कें बहु तुलना परीक्षण कें उपयोग करल गेलय छेलै. डेटा बिंदु प्रत्येक व्यक्तिगत कोशिका के लेल औसत माइटोकॉन्ड्रिया मान के प्रतिनिधित्व करैत अछि, आ त्रुटि बार औसत ± SEM के प्रतिनिधित्व करैत अछि | दिखायल गेल आंकड़ा n = 3, कम सं कम 24 कोशिका प्रति प्रतिकृति कें प्रतिनिधित्व करय छै; कुल 266 छविक विश्लेषण कयल गेल; * p < 0.05 इंगित करैत अछि, ** p < 0.01 इंगित करैत अछि |
आरू विशेषता के लेलऽ कि माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता पीपीए के प्रति केना प्रतिक्रिया दै छै, हमन॑ माइटोकॉन्ड्रिया क॑ टेट्रामिथाइलरोडामाइन एथिल एस्टर (टीएमआरई) स॑ रंगलऽ गेलै आरू 3 आरू 5 एमएम पीपीए प॑ 24 घंटा के बाद माइटोकॉन्ड्रिया क॑ स्थानीयकृत आरू मात्रा निर्धारित करै लेली टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी आरू एमईएल विश्लेषण के इस्तेमाल करलकै । विखंडन एवं संलयन घटनाओं का उपचार। (चित्र 2 क)। एमईएल विश्लेषण के बाद माइटोकॉन्ड्रिया के आगू विश्लेषण करलऽ गेलै ताकि माइटोकॉन्ड्रिया संरचना के संख्या आरू ओकरऽ औसत आयतन के मात्रा निर्धारित करलऽ जाय सक॑ । हमनें विखंडन [5.6 ± 0.3 (पी <0.05) )] आरू संलयन [5.4 ± 0.5 (पी <0.05)] आरू संलयन [5.4 ± 0.5 (पी <0.05)] आरू संलयन [5.4 ± 0.5 (पी < 0.05)] 0.05)] <0.05)] घटनाओ ंमें नियंत्रण (चित्र 3b) की तुलना मे 5 एमएम पर काफी वृद्धि हुई | माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ संख्या म॑ 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] आरू 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (चित्र 3c) दूनू प॑ काफी वृद्धि होय गेलै, जबकि प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रिया संरचना केरऽ औसत आयतन अपरिवर्तित रहलै (चित्र 3c) । 3घ)। एकरा मिला क॑ देखलऽ जाय त॑ ई स॑ पता चलै छै कि माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता केरऽ रिमोडलिंग एगो क्षतिपूर्ति प्रतिक्रिया के रूप म॑ काम करै छै जे माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क केरऽ अखंडता क॑ सफलतापूर्वक बनाए रखै छै । 3 एमएम पीपीए पर विखंडन घटना के संख्या म॑ वृद्धि स॑ पता चलै छै कि माइटोकॉन्ड्रिया संख्या म॑ वृद्धि कुछ हद तलक माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विखंडन के कारण छै, लेकिन ई देखत॑ कि औसत माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ आयतन अनिवार्य रूप स॑ अपरिवर्तित रहै छै, जैवजनन क॑ अतिरिक्त क्षतिपूर्ति प्रतिक्रिया के रूप म॑ खारिज नै करलऽ जाब॑ सकै छै । लेकिन ई आंकड़ा टीईएम द्वारा देखलऽ गेलऽ छोटऽ, गोल माइटोकॉन्ड्रिया संरचना के अनुरूप छै आरू पीपीए द्वारा प्रेरित माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता म॑ भी महत्वपूर्ण परिवर्तन के प्रदर्शन करै छै ।
प्रोपिओनिक एसिड (पीपीए) नेटवर्क अखंडता कें बनाए रखय कें लेल गतिशील माइटोकॉन्ड्रिया रिमोडलिंग कें प्रेरित करय छै. SH-SY5Y कोशिका क॑ संवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै, 3 आरू 5 mM PPA स॑ 24 घंटा तलक उपचारित करलऽ गेलऽ छेलै आरू TMRE आरू Hoechst 33342 स॑ रंगलऽ गेलऽ छेलै आरू ओकरऽ बाद MEL विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै । (क) प्रत्येक स्थिति के लेल समय 2 (t2) पर रंग आ द्विआधारित अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के चित्रण करय वाला प्रतिनिधि समय-अंतराल सूक्ष्मदर्शी छवि. प्रत्येक बाइनरी छवि म॑ संकेत करलऽ गेलऽ चयनित क्षेत्रऽ क॑ बढ़ालऽ जाय छै आरू समय के साथ गतिशीलता क॑ दर्शाबै लेली तीन अलग-अलग समय सीमा (t1-t3) प॑ 3D म॑ प्रदर्शित करलऽ जाय छै; संलयन घटना सभकेँ हरियर रंगसँ हाइलाइट कएल गेल अछि; विखंडन घटना सभकेँ हरियर रंगसँ हाइलाइट कएल गेल अछि । लाल रंग मे प्रदर्शित। (ख) प्रति शर्त गतिशील घटनाओं की औसत संख्या | (ग) प्रति कोशिका माइटोकॉन्ड्रिया संरचनाओं की औसत संख्या | (घ) प्रति कोशिका प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रिया संरचना का औसत आयतन (μm3)। दिखायल गेल आंकड़ा प्रति उपचार समूह n = 15 कोशिका कें प्रतिनिधित्व करय छै. दिखायल गेलय त्रुटि बार औसत ± SEM, पैमाने पट्टी = 10 μm, * पी <0.05 कें प्रतिनिधित्व करय छै.
प्रोपिओनिक एसिड (PPA) माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता स॑ जुड़लऽ जीनऽ के ट्रांसक्रिप्शनल दमन के कारण बन॑ छै । SH-SY5Y कोशिका क॑ 3 आरू 5 एमएम पीपीए स॑ 24 घंटा तलक उपचारित करलऽ गेलऽ छेलै । सापेक्ष जीन मात्रा निर्धारण आरटी-क्यूपीसीआर के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै आरू बी 2 एम म॑ सामान्य करलऽ गेलऽ छेलै । माइटोकॉन्ड्रिया जैवजनन जीन (क) cMYC, (ख) TFAM, (ग) NRF1 और (d) NFE2L2 | माइटोकॉन्ड्रिया संलयन एवं विखंडन जीन (ङ) STOML2, (च) OPA1, (छ) MFN1, (ज) MFN2 एवं (i) DRP1 | एकतरफा एनोवा (नियंत्रण बनाम उपचार) आरू डनेट केरऽ बहु तुलना परीक्षण के उपयोग करी क॑ महत्वपूर्ण अंतर (पी <0.05) के परीक्षण करलऽ गेलऽ छेलै: * पी <0.05 क॑ दर्शाबै छै, ** पी <0.01 क॑ दर्शाबै छै, आरू **** पी <0.0001 क॑ दर्शाबै छै । बार औसत अभिव्यक्ति ± एसईएम प्रतिनिधित्व करता है। दिखायल गेलय आंकड़ा n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), आरू n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) जैविक प्रतिकृति कें प्रतिनिधित्व करय छै.
टीईएम आरू एमईएल विश्लेषण स॑ मिललऽ आंकड़ा मिल क॑ संकेत करै छै कि पीपीए माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ आकृति विज्ञान आरू गतिशीलता म॑ बदलाव करै छै । लेकिन ई इमेजिंग तकनीक ई प्रक्रिया सब क॑ चलाबै वाला अंतर्निहित तंत्र के बारे म॑ जानकारी नै दै छै । अतः हमनें पीपीए उपचार के प्रतिक्रिया म॑ माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता, जैवजनन, आरू माइटोसिस केरऽ नौ प्रमुख नियामकऽ के mRNA अभिव्यक्ति के जांच करलकै । हमनें सेल मायलोमा ऑन्कोजीन (cMYC), न्यूक्लियर रेस्पिरेटरी फैक्टर (NRF1), माइटोकॉन्ड्रिया ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 1 (TFAM), NFE2-जैसे ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर BZIP (NFE2L2), गैस्ट्रिन जैसा प्रोटीन 2 (STOML2), ऑप्टिक नर्व शोष 1 (OPA1 ), माइटोफ्यूजिन 1 (MFN1), माइटोफ्यूसिन 2 (MFN2) आरू डायनामिन सं संबंधित प्रोटीन 1 (DRP1) कें 3 एमएम आ 5 एमएम पीपीए सं 24 घंटा कें उपचार कें बाद. हमनें 3 एमएम (पी = 0.0053, पी = 0.0415 आरू पी <0.0001, क्रमशः) आरू 5 एमएम (पी = 0.0031, पी = 0.0233, पी <0.0001) पीपीए उपचार देखलऽ गेलै । (चित्र 3क–ग)। mRNA अभिव्यक्ति म॑ कमी ​​खुराक-निर्भर छेलै: cMYC, NRF1 आरू TFAM केरऽ अभिव्यक्ति म॑ क्रमशः 3 mM प॑ 5.7, 2.6 आरू 1.9 गुना आरू 5 mM प॑ 11.2, 3 आरू 2.2 गुना कमी आबी गेलऽ छेलै । एकरऽ विपरीत, केंद्रीय रेडॉक्स बायोजेनेसिस जीन NFE2L2 म॑ पीपीए केरऽ कोनों भी सांद्रता म॑ बदलाव नै करलऽ गेलऽ छेलै, हालांकि अभिव्यक्ति म॑ कमी ​​केरऽ समान खुराक-निर्भर प्रवृत्ति देखलऽ गेलऽ छेलै (चित्र 3d) ।
हमनें विखंडन आरू संलयन के नियमन म॑ शामिल शास्त्रीय जीन के अभिव्यक्ति के भी जांच करलकै । STOML2 क॑ फ्यूजन, माइटोफेजी आरू बायोजेनेसिस म॑ शामिल मानलऽ जाय छै, आरू एकरऽ अभिव्यक्ति म॑ 3 एमएम (2.4-गुना परिवर्तन) आरू 5 एमएम (2.8-गुना परिवर्तन) पीपीए (चित्र 1) स॑ काफी कमी (p < 0.0001) होय गेलऽ छेलै । 3घ)। इसी तरह, OPA1 फ्यूजन जीन अभिव्यक्ति 3 एमएम (1.6-गुना परिवर्तन) आरू 5 एमएम (1.9-गुना परिवर्तन) पीपीए (क्रमशः पी = 0.006 आरू पी = 0.0024) (चित्र 3f) प॑ कम होय गेलऽ छेलै । लेकिन, हमनें 24-घंटा पीपीए तनाव (चित्र 3g-i) के तहत फ्यूजन जीन MFN1, MFN2 या विखंडन जीन DRP1 के अभिव्यक्ति म॑ महत्वपूर्ण अंतर नै मिललै । एकरऽ अलावा, हमनी न॑ पालै छै कि चारि फ्यूजन आरू फिशन प्रोटीन (OPA1, MFN1, MFN2 आरू DRP1) केरऽ स्तर म॑ एक ही परिस्थिति म॑ बदलाव नै आबै छै (चित्र 4a–d) । इ ध्यान देनाय महत्वपूर्ण छै कि इ आंकड़ा समय कें एकटा बिंदु कें दर्शाबै छै आ पीपीए तनाव कें प्रारंभिक चरणक कें दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति या गतिविधि स्तर मे बदलाव कें प्रतिबिंबित नहि कयर सकय छै. लेकिन, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, आरू OPA1 केरऽ अभिव्यक्ति म॑ महत्वपूर्ण कमी माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय, जैवजनन, आरू गतिशीलता केरऽ महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शनल डिसरेगुलेशन के संकेत दै छै । एकरऽ अलावा, ई आंकड़ा माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ कार्य म॑ अंतिम अवस्था म॑ बदलाव के सीधा अध्ययन करै लेली इमेजिंग तकनीक के उपयोगिता प॑ प्रकाश डालै छै ।
प्रोपिओनिक एसिड (पीपीए) उपचार के बाद फ्यूजन आरू फिशन फैक्टर प्रोटीन के स्तर म॑ कोनो बदलाव नै ऐलै । SH-SY5Y कोशिका क॑ 3 आरू 5 एमएम पीपीए स॑ 24 घंटा तलक उपचारित करलऽ गेलऽ छेलै । प्रोटीन केरऽ स्तर क॑ वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू अभिव्यक्ति केरऽ स्तर क॑ कुल प्रोटीन म॑ सामान्य करलऽ गेलऽ छेलै । औसत प्रोटीन अभिव्यक्ति आ लक्ष्य आ कुल प्रोटीन के प्रतिनिधि वेस्टर्न ब्लॉट देखाओल गेल अछि । क – ओपीए1, ख – एमएफएन1, ग – एमएफएन2, घ – डीआरपी1। बार औसत ± SEM कें प्रतिनिधित्व करय छै, आरू दिखायल गेलय आंकड़ा n = 3 जैविक प्रतिकृति कें प्रतिनिधित्व करय छै. विचरण केरऽ एकतरफा विश्लेषण आरू डनेट केरऽ परीक्षण के उपयोग करी क॑ कई तुलना (पी < 0.05) करलऽ गेलऽ छेलै । मूल जेल आ ब्लॉट चित्र S1 मे दिखायल गेल छै.
माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार चयापचय, हृदय आरू मांसपेशी केरऽ बीमारी स॑ ल॑ क॑ न्यूरोलॉजिकल बीमारी तलक के बहुतंत्र रोगऽ स॑ जुड़लऽ छै1,10 । बहुत रास न्यूरोडिजनरेटिव आ न्यूरोडिजनरेटिव रोग माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार स॑ जुड़लऽ छै, जे मस्तिष्क केरऽ पूरा जीवन काल म॑ ई ऑर्गेनेल केरऽ महत्व प॑ प्रकाश डालै छै । एहि बीमारी मे पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग आ एएसडी3,4,18 शामिल अछि । लेकिन, ई बीमारियऽ के अध्ययन लेली मस्तिष्क के ऊतकऽ तलक पहुँच मुश्किल छै, खास करी क॑ यंत्रवत् स्तर प॑, जेकरा स॑ कोशिकीय मॉडल प्रणाली एगो आवश्यक विकल्प बनी जाय छै । ई अध्ययन म॑, हम्मं॑ न्यूरॉनल रोग, विशेष रूप स॑ ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकार म॑ देखलऽ गेलऽ माइटोकॉन्ड्रिया विकार क॑ पुनः संक्षेप म॑ रखै लेली पीपीए-उपचारित SH-SY5Y कोशिका के उपयोग करी क॑ एक कोशिकीय मॉडल प्रणाली के उपयोग करै छियै । न्यूरॉन्स म॑ माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता के अध्ययन लेली ई पीपीए मॉडल के उपयोग स॑ एएसडी केरऽ एटियलजि के बारे म॑ जानकारी मिल॑ सकै छै ।
हमनें माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान म॑ बदलाव क॑ देखै लेली टीईएम के उपयोग करै के संभावना के खोज करलकै । इ ध्यान देनाय महत्वपूर्ण छै कि एकर प्रभावशीलता कें अधिकतम करय कें लेल टीईएम कें सही उपयोग करनाय आवश्यक छै. क्रायो-नमूना के तैयारी स॑ एक साथ कोशिकीय घटकऽ क॑ ठीक करी क॑ आरू आर्टिफैक्ट के निर्माण क॑ कम करी क॑ न्यूरॉनल संरचना के बेहतर संरक्षण के अनुमति मिलै छै34 । एकरऽ अनुरूप, हमन॑ देखलऽ कि न्यूरॉन जैसनऽ SH-SY5Y कोशिका म॑ बरकरार उपकोशिकीय ऑर्गेनेल आरू लम्बा माइटोकॉन्ड्रिया छेलै (चित्र 1a) । ई न्यूरॉनल कोशिका मॉडल म॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान के अध्ययन लेली क्रायोजेनिक तैयारी तकनीक के उपयोगिता प॑ प्रकाश डालै छै । यद्यपि टीईएम आँकड़ा के वस्तुनिष्ठ विश्लेषण लेली मात्रात्मक मापन महत्वपूर्ण छै, लेकिन माइटोकॉन्ड्रिया के रूपात्मक परिवर्तन के पुष्टि करै लेली कोन-कोन विशिष्ट पैरामीटर के मापन करलऽ जाय, ई बात प॑ अखनी तलक कोनो सहमति नै छै । एक बड़ी संख्या म॑ अध्ययनऽ के आधार प॑ जेकरा न॑ मात्रात्मक रूप स॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान17,31,32 के जांच करलकै, हमन॑ एक स्वचालित माइटोकॉन्ड्रिया छवि विश्लेषण पाइपलाइन विकसित करलकै जे आठ आकृति विज्ञान पैरामीटर क॑ मापै छै, अर्थात: क्षेत्र, क्षेत्र2, पहलू अनुपात, परिधि, परिपत्रता, डिग्री , फेरेट व्यास । आ गोल-गोलता।
इनमें से पीपीए न॑ क्षेत्रफल 2, क्षेत्रफल, परिधि, आरू फेरेट व्यास (चित्र 1b–e) म॑ काफी कमी करलकै । ई स॑ पता चललै कि माइटोकॉन्ड्रिया छोटऽ आरू गोल होय गेलै, जे कि पिछला अध्ययनऽ के अनुरूप छै जेकरा म॑ पीपीए३०-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रिया तनाव के ७२ घंटा के बाद माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्र म॑ कमी ​​देखलऽ गेलऽ छै । ई रूपात्मक विशेषता माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन के संकेत द॑ सकै छै, जे माइटोफेजी के माध्यम स॑ ओकरऽ अपघटन क॑ बढ़ावा दै लेली माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क स॑ क्षतिग्रस्त घटकऽ क॑ अलग करै लेली एगो आवश्यक प्रक्रिया छै35,36,37 । दोसरऽ तरफ औसत माइटोकॉन्ड्रिया आकार म॑ कमी ​​जैवजनन म॑ वृद्धि स॑ जुड़लऽ होय सकै छै, जेकरऽ परिणामस्वरूप छोटऽ नवजात माइटोकॉन्ड्रिया के निर्माण होय छै । बढ़लऽ विखंडन या जैवजनन माइटोकॉन्ड्रिया तनाव के खिलाफ माइटोसिस क॑ बनाए रखै लेली एक क्षतिपूर्ति प्रतिक्रिया के प्रतिनिधित्व करै छै । मुदा, माइटोकॉन्ड्रियाक विकास मे कमी, बिगड़ल फ्यूजन, वा अन्य स्थिति कें बाहर नहिं कयल जा सकैत अछि ।
यद्यपि टीईएम द्वारा बनाओल गेल उच्च रिजोल्यूशन वाला छवि व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के स्तर पर आकृति विज्ञान के विशेषता के निर्धारण के अनुमति दैत अछि, मुदा ई विधि समय के एकल बिंदु पर द्वि-आयामी स्नैपशॉट पैदा करैत अछि । चयापचय तनाव के गतिशील प्रतिक्रिया के अध्ययन करै लेली, हमन॑ माइटोकॉन्ड्रिया क॑ टीएमआरई स॑ रंगलऽ आरू एमईएल विश्लेषण के साथ टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के इस्तेमाल करलकै, जे समय के साथ माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क म॑ बदलाव के उच्च-थ्रूपुट 3D विजुअलाइजेशन के अनुमति दै छै33,38 । हमनें पीपीए तनाव (चित्र 2) के तहत माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता म॑ सूक्ष्म लेकिन महत्वपूर्ण परिवर्तन देखलऽ गेलै । 3 एमएम पर विखंडन घटना के संख्या काफी बढ़ी गेलै, जबकि संलयन घटना नियंत्रण के तरह ही रहलै । 5 एमएम पीपीए पर विखंडन आरू संलयन दूनू घटना के संख्या म॑ वृद्धि देखलऽ गेलऽ छेलै, लेकिन ई परिवर्तन लगभग आनुपातिक छेलै, जेकरा स॑ पता चलै छै कि विखंडन आरू संलयन गतिकी अधिक सांद्रता प॑ संतुलन तक पहुँचै छै (चित्र 2b) । औसत माइटोकॉन्ड्रिया आयतन 3 आरू 5 एमएम पीपीए दूनू पर अपरिवर्तित रहलै, जे ई दर्शाबै छै कि माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क केरऽ अखंडता सुरक्षित छेलै (चित्र 2d) । ई गतिशील माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क केरऽ हल्का चयापचय तनाव के प्रतिक्रिया दै के क्षमता क॑ दर्शाबै छै ताकि नेटवर्क केरऽ विखंडन के कारण बिना होमोस्टेसिस क॑ प्रभावी ढंग स॑ बनाए रखलऽ जाय सक॑ । 3 एमएम पीपीए पर, विखंडन म॑ वृद्धि एगो नया संतुलन म॑ संक्रमण क॑ बढ़ावा दै लेली पर्याप्त छै, लेकिन पीपीए केरऽ अधिक सांद्रता स॑ प्रेरित तनाव के प्रतिक्रिया म॑ अधिक गहन गतिज रिमोडलिंग के आवश्यकता होय छै ।
पीपीए तनाव केरऽ दूनू सांद्रता प॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ संख्या बढ़ी गेलै, लेकिन औसत माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ आयतन म॑ कोनो खास बदलाव नै ऐलै (चित्र 2c) । एकर कारण जैवजनन बढ़ल वा विभाजन बढ़ल भ सकैत अछि; तथापि, औसत माइटोकॉन्ड्रिया आयतन म॑ काफी कमी के अभाव म॑ जैव संश्लेषण बढ़ै के संभावना अधिक होय छै । लेकिन, चित्र 2 म॑ देलऽ गेलऽ आंकड़ा दू क्षतिपूर्ति तंत्र के अस्तित्व के समर्थन जरूर करै छै: विखंडन घटना के संख्या म॑ वृद्धि, जे माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन के अपरेग्यूलेशन के अनुरूप छै, आरू घटना के संख्या म॑ वृद्धि, जे माइटोकॉन्ड्रिया जैवजनन के अनुरूप छै । अंततः, हल्का तनाव केरऽ गतिशील क्षतिपूर्ति म॑ एक साथ प्रक्रिया शामिल होय सकै छै जेकरा म॑ विखंडन, संलयन, जैवजनन, आरू माइटोफेजी शामिल छै । यद्यपि पिछला लेखक न॑ ई देखैल॑ छै कि पीपीए माइटोसिस30,39 आरू माइटोफेजी29 क॑ बढ़ाबै छै, लेकिन हम पीपीए के प्रतिक्रिया म॑ माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन आरू संलयन गतिशीलता के रिमोडलिंग के सबूत उपलब्ध करै छियै । ई आंकड़ा टीईएम द्वारा देखलऽ गेलऽ आकृति संबंधी परिवर्तन के पुष्टि करै छै आरू पीपीए-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रिया विकार स॑ जुड़लऽ तंत्र के बारे म॑ आरू जानकारी प्रदान करै छै ।
चूँकि न त॑ टीईएम आरू न ही एमईएल विश्लेषण न॑ देखलऽ गेलऽ आकृति संबंधी परिवर्तनऽ के अंतर्निहित जीन नियामक तंत्र के सीधा सबूत उपलब्ध कराय देलकै, हम्मं॑ माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय, जैवजनन, आरू गतिशीलता म॑ शामिल जीनऽ के आरएनए अभिव्यक्ति के जांच करलकै । cMYC प्रोटो-ऑन्कोजीन एकटा ट्रांसक्रिप्शन कारक छै जे माइटोकॉन्ड्रिया, ग्लाइकोलाइसिस, अमीनो एसिड आ फैटी एसिड चयापचय कें नियमन मे शामिल छै40. एकरऽ अलावा, cMYC क॑ NRF1 आरू TFAM41 सहित माइटोकॉन्ड्रिया ट्रांसक्रिप्शन, अनुवाद, आरू जटिल असेंबली म॑ शामिल लगभग 600 माइटोकॉन्ड्रिया जीन के अभिव्यक्ति क॑ नियंत्रित करै लेली जानलऽ जाय छै । एनआरएफ१ आरू टीएफएएम माइटोसिस केरऽ दू केंद्रीय नियामक छै, जे पीजीसी-१α केरऽ डाउनस्ट्रीम म॑ काम करी क॑ mtDNA प्रतिकृति क॑ सक्रिय करै छै । ई मार्ग cAMP आरू AMPK संकेत द्वारा सक्रिय होय छै आरू ऊर्जा व्यय आरू चयापचय तनाव के प्रति संवेदनशील होय छै. हमनें माइटोकॉन्ड्रिया जैवजनन केरऽ रेडॉक्स नियामक NFE2L2 केरऽ भी जांच करलकै, ई तय करै लेली कि पीपीए केरऽ प्रभाव ऑक्सीडेटिव तनाव के माध्यम स॑ होय सकै छै कि नै ।
यद्यपि NFE2L2 अभिव्यक्ति अपरिवर्तित रहल, हम 3 एमएम आरू 5 एमएम पीपीए (चित्र 3a-c) के साथ उपचार के 24 घंटा के बाद cMYC, NRF1 आरू TFAM के अभिव्यक्ति म॑ लगातार खुराक-निर्भर कमी पाबै छै । cMYC अभिव्यक्ति केरऽ डाउनरेगुलेशन क॑ पहिने माइटोकॉन्ड्रिया तनाव के प्रतिक्रिया के रूप म॑ रिपोर्ट करलऽ गेलऽ छै42, आरू एकरऽ विपरीत, cMYC अभिव्यक्ति केरऽ डाउनरेगुलेशन माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय, नेटवर्क कनेक्टिविटी, आरू झिल्ली ध्रुवीकरण क॑ रिमोडलिंग करी क॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार पैदा करी सकै छै43 । दिलचस्प बात ई छै कि cMYC माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन आरू संलयन के नियमन म॑ भी शामिल छै42,43 आरू कोशिका विभाजन के दौरान DRP1 फॉस्फोरिलेशन आरू माइटोकॉन्ड्रिया स्थानीयकरण क॑ बढ़ाबै लेली जानलऽ जाय छै44, साथ ही साथ न्यूरॉनल स्टेम कोशिका म॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति संबंधी रिमोडलिंग के मध्यस्थता करै छै45 । दरअसल, cMYC-कमी वाला फाइब्रोब्लास्ट माइटोकॉन्ड्रिया आकार म॑ कमी ​​प्रदर्शित करै छै, जे PPA43 तनाव स॑ प्रेरित परिवर्तन के अनुरूप छै । ई आंकड़ा cMYC आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता के बीच एगो रोचक लेकिन अभी तलक अस्पष्ट संबंध के दर्शाबै छै, जे पीपीए तनाव-प्रेरित रिमोडलिंग के भविष्य के अध्ययन लेली एगो रोचक लक्ष्य प्रदान करै छै.
एनआरएफ१ आरू टीएफएएम केरऽ कमी एगो महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर के रूप म॑ cMYC के भूमिका के अनुरूप छै । ई आंकड़ा मानव बृहदान्त्र कैंसर कोशिका मँ पिछला अध्ययन के अनुरूप भी छै जेकरा स॑ पता चलै छै कि पीपीए न॑ 22 घंटा म॑ एनआरएफ1 एमआरएनए अभिव्यक्ति म॑ कमी ​​करलकै, जे एटीपी केरऽ कमी आरू आरओएस46 म॑ वृद्धि स॑ जुड़लऽ छेलै । ई लेखकऽ न॑ ई भी रिपोर्ट करलकै कि टीएफएएम अभिव्यक्ति ८.५ घंटा म॑ बढ़ी गेलै लेकिन २२ घंटा म॑ बेसलाइन लेवल प॑ वापस आबी गेलै । एकर विपरीत, किम एट अल। (2019) न॑ देखैलकै कि SH-SY5Y कोशिका म॑ पीपीए तनाव के 4 घंटा के बाद TFAM mRNA अभिव्यक्ति म॑ काफी कमी आबी गेलऽ छेलै; तथापि, 72 घंटाक बाद, TFAM प्रोटीन अभिव्यक्ति मे काफी वृद्धि भेल आ mtDNA कॉपी संख्या मे काफी वृद्धि भेल । एहि तरहें, माइटोकॉन्ड्रिया जैवजनन जीन के संख्या में कमी जे हम सब 24 घंटा के बाद देखलहुं, एहि संभावना के बाहर नहिं करैत अछि जे माइटोकॉन्ड्रिया के संख्या में वृद्धि पहिने के समय बिंदु पर जैवजनन के सक्रियता सं जुड़ल अछि. पिछला अध्ययनऽ स॑ पता चललै छै कि पीपीए SH-SY5Y कोशिका म॑ PGC-1α mRNA आरू प्रोटीन क॑ 4 घंटा 30 मिनट म॑ काफी अपरेगुलेट करै छै, जबकि प्रोपिओनिक एसिड पीजीसी-1α के माध्यम स॑ बछड़ा के हेपेटोसाइट्स म॑ माइटोकॉन्ड्रिया जैवजनन क॑ 12 घंटा 39 मिनट म॑ बढ़ाबै छै । दिलचस्प बात ई छै कि पीजीसी-1α न सिर्फ एनआरएफ1 आरू टीएफएएम केरऽ सीधा ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेटर छै, बल्कि एकरा विखंडन आरू संलयन क॑ नियंत्रित करी क॑ एमएफएन2 आरू डीआरपी1 केरऽ गतिविधि क॑ नियंत्रित करै के काम भी दिखालऽ गेलऽ छै47 । एक साथ लेलऽ जाय त॑ ई पीपीए द्वारा प्रेरित माइटोकॉन्ड्रिया क्षतिपूर्ति प्रतिक्रिया क॑ नियंत्रित करै वाला तंत्रऽ के करीबी युग्मन प॑ प्रकाश डालै छै । एतबे नै, हमरऽ आंकड़ा पीपीए तनाव के तहत जैवजनन आरू चयापचय केरऽ ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन केरऽ महत्वपूर्ण विनियमन क॑ दर्शाबै छै ।
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 आरू DRP1 जीन माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन, संलयन आरू गतिशीलता के केंद्रीय नियामकऽ म॑ शामिल छै37,48,49 । माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता म॑ बहुत सारा अन्य जीन शामिल छै, हालांकि, STOML2, OPA1 आरू MFN2 क॑ पहिने एएसडी कोहोर्ट म॑ अंतर स॑ मिथाइल होय वाला पाबै गेलऽ छै,16 आरू कई स्वतंत्र अध्ययनऽ म॑ माइटोकॉन्ड्रिया तनाव के प्रतिक्रिया म॑ ई ट्रांसक्रिप्शन कारक म॑ बदलाव के रिपोर्ट करलऽ गेलऽ छै50,51 । 52. OPA1 आरू STOML2 दूनू के अभिव्यक्ति म॑ 3 एमएम आरू 5 एमएम पीपीए उपचार (चित्र 3e, f) स॑ काफी कमी आबी गेलऽ छेलै । ओपीए1 एमएफएन1 आरू 2 के साथ सीधा बातचीत के माध्यम स॑ माइटोकॉन्ड्रिया संलयन के शास्त्रीय नियामकऽ म॑ स॑ एक छै आरू क्रिस्टे रिमोडलिंग आरू माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान म॑ भूमिका निभाबै छै53 । माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता म॑ STOML2 केरऽ सटीक भूमिका अस्पष्ट छै, लेकिन सबूतऽ स॑ पता चलै छै कि ई माइटोकॉन्ड्रिया संलयन, जैवजनन, आरू माइटोफेजी म॑ भूमिका निभाबै छै ।
STOML2 माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन युग्मन क॑ बनाए रखै आरू श्वसन श्रृंखला परिसर केरऽ निर्माण म॑ शामिल छै54,55 आरू कैंसर कोशिका केरऽ चयापचय विशेषता म॑ गहराई स॑ बदलाव करै वाला देखलऽ गेलऽ छै56 । अध्ययनऽ स॑ पता चललै छै कि STOML2 BAN आरू कार्डियोलिपिन के साथ बातचीत के माध्यम स॑ माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली क्षमता आरू जैवजनन क॑ बढ़ावा दै छै 55, 57, 58. एकरऽ अतिरिक्त, स्वतंत्र अध्ययनऽ स॑ पता चललै छै कि STOML2 आरू PINK1 के बीच बातचीत माइटोफेजी क॑ नियंत्रित करै छै59,60. उल्लेखनीय छै कि STOML2 क॑ सीधे MFN2 के साथ बातचीत आरू स्थिर करै के रिपोर्ट करलऽ गेलऽ छै आरू OPA1 केरऽ गिरावट लेली जिम्मेदार प्रोटीज क॑ रोकी क॑ लंबा OPA1 आइसोफॉर्म क॑ स्थिर करै म॑ भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाबै छै53,61,62 । पीपीए प्रतिक्रिया म॑ देखलऽ गेलऽ STOML2 अभिव्यक्ति म॑ कमी ​​ई फ्यूजन प्रोटीन क॑ यूबिक्विटिन- आरू प्रोटीसोम-निर्भर मार्ग के माध्यम स॑ अपघटन के अधिक संवेदनशील बना सकै छै48 । यद्यपि पीपीए के प्रति गतिशील प्रतिक्रिया म॑ STOML2 आरू OPA1 के सटीक भूमिका अस्पष्ट छै, लेकिन ई संलयन जीनऽ के अभिव्यक्ति म॑ कमी ​​(चित्र 3) विखंडन आरू संलयन के बीच संतुलन क॑ बाधित करी सकै छै आरू माइटोकॉन्ड्रिया के आकार म॑ कमी ​​आबी सकै छै (चित्र 3) । १)।
दोसरऽ तरफ, OPA1 प्रोटीन अभिव्यक्ति 24 घंटा के बाद भी अपरिवर्तित रहलै, जबकि पीपीए उपचार के बाद MFN1, MFN2 या DRP1 के mRNA आरू प्रोटीन के स्तर म॑ कोनो खास बदलाव नै ऐलै (चित्र 3g-i, चित्र 4) । ई संकेत करी सकै छै कि माइटोकॉन्ड्रिया संलयन आरू विखंडन म॑ शामिल ई कारकऽ के नियमन म॑ कोनो बदलाव नै छै । लेकिन ई बात ध्यान देबऽ के बात छै कि ई चारो जीनऽ म॑ स॑ हर जीन क॑ पोस्टट्रांस्क्रिप्शनल मोडिफिकेशन (पीटीएम) द्वारा भी नियंत्रित करलऽ जाय छै जे प्रोटीन केरऽ गतिविधि क॑ नियंत्रित करै छै । OPA1 म॑ आठ वैकल्पिक स्प्लिस वेरिएंट छै जे माइटोकॉन्ड्रिया म॑ प्रोटीओलाइटिक रूप स॑ विच्छेदित होय क॑ दू अलग-अलग आइसोफॉर्म 63 पैदा करलऽ जाय छै । लंबा आरू छोटऽ आइसोफॉर्म के बीच के संतुलन अंततः माइटोकॉन्ड्रिया संलयन आरू माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क केरऽ रखरखाव म॑ ओपीए१ के भूमिका क॑ निर्धारित करै छै64 । DRP1 गतिविधि कैल्शियम/कैल्मोडुलिन-निर्भर प्रोटीन किनेज़ II (CaMKII) फॉस्फोरिलेशन द्वारा नियंत्रित करलऽ जाय छै, जबकि DRP1 अपघटन यूबिक्विटिनेशन आरू SUMOylation द्वारा नियंत्रित होय छै65 । अंत में, DRP1 आरू MFN1/2 दूनू GTPases छै, अतः माइटोकॉन्ड्रिया 66 म॑ GTP उत्पादन केरऽ दर स॑ गतिविधि प्रभावित होय सकै छै । अतः, यद्यपि ई प्रोटीनऽ के अभिव्यक्ति स्थिर रहै छै, लेकिन ई अपरिवर्तित प्रोटीन गतिविधि या स्थानीयकरण के प्रतिबिंबित नै करी सकै छै67,68 । वास्तव म॑, मौजूदा पीटीएम प्रोटीन रेपर्टरी अक्सर तीव्र तनाव प्रतिक्रिया के मध्यस्थता लेली जिम्मेदार रक्षा केरऽ पहिलऽ लाइन के रूप म॑ काम करै छै । हमरऽ मॉडल म॑ मध्यम चयापचय तनाव के उपस्थिति म॑ ई संभावना छै कि पीटीएम संलयन आरू विखंडन प्रोटीन केरऽ बढ़लऽ गतिविधि क॑ बढ़ावा दै छै ताकि माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ अखंडता क॑ पर्याप्त रूप स॑ बहाल करलऽ जाय सक॑ आरू एमआरएनए या प्रोटीन स्तर प॑ ई जीनऽ के अतिरिक्त सक्रियता के जरूरत नै होय सक॑ ।
एक साथ लेलऽ जाय त॑ उपरोक्त आंकड़ा माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान केरऽ जटिल आरू समय-निर्भर नियमन आरू ई तंत्रऽ क॑ स्पष्ट करै के चुनौतियऽ प॑ प्रकाश डालै छै । जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन करै लेली सबसें पहल॑ मार्ग म॑ विशिष्ट लक्षित जीन के पहचान करना जरूरी छै । लेकिन, हमरऽ डाटा स॑ पता चलै छै कि एक ही मार्ग म॑ मौजूद जीन एक ही तनाव के प्रति एक जैसनऽ प्रतिक्रिया नै दै छै । वास्तव म॑, पिछला अध्ययनऽ स॑ पता चललै छै कि एक ही मार्ग म॑ अलग-अलग जीन अलग-अलग टेम्पोरल रिस्पांस प्रोफाइल प्रदर्शित करी सकै छै30,46 । एकरऽ अलावा जटिल पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र छै जे ट्रांसक्रिप्शन आरू जीन फंक्शन के बीच संबंध क॑ बाधित करै छै । प्रोटीओमिक अध्ययन पीटीएम आरू प्रोटीन केरऽ कार्य केरऽ प्रभाव के बारे म॑ जानकारी द॑ सकै छै, लेकिन ई कम-थ्रूपुट विधि, उच्च सिग्नल-टू-नॉइज अनुपात, आरू खराब रिजोल्यूशन सहित चुनौती भी पैदा करै छै ।
ई संदर्भ म॑ टीईएम आरू एमईएल के उपयोग करी क॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान के अध्ययन स॑ माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता आरू कार्य के बीच संबंध आरू ई बीमारी क॑ कोना प्रभावित करै छै, ई के बारे म॑ मौलिक सवालऽ क॑ संबोधित करै के बहुत संभावना छै । सबस॑ महत्वपूर्ण बात ई छै कि टीईएम माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार आरू गतिशीलता केरऽ अभिसरण अंतिम बिंदु के रूप म॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान क॑ मापै लेली एगो सीधा तरीका प्रदान करै छै51 । एमईएल तीन आयामी कोशिकीय वातावरण म॑ विखंडन आरू संलयन घटना क॑ दृश्यमान करै लेली एगो सीधा तरीका भी प्रदान करै छै, जेकरा स॑ जीन अभिव्यक्ति म॑ बदलाव के अभाव म॑ भी गतिशील माइटोकॉन्ड्रिया रिमोडलिंग केरऽ मात्रा निर्धारण के अनुमति मिलै छै33 । यहाँ हम माध्यमिक माइटोकॉन्ड्रिया रोगों म॑ माइटोकॉन्ड्रिया इमेजिंग तकनीक के उपयोगिता प॑ प्रकाश डालै छियै । ई बीमारियक कें विशेषता आमतौर पर पुरानी हल्का चयापचय तनाव छै जेकर विशेषता छै तीव्र माइटोकॉन्ड्रिया क्षति कें बजाय माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क कें सूक्ष्म रिमोडलिंग. लेकिन, पुरानी तनाव के तहत माइटोसिस क॑ बनाए रखै लेली आवश्यक माइटोकॉन्ड्रिया क्षतिपूर्ति केरऽ गहरा कार्यात्मक परिणाम होय छै । तंत्रिका विज्ञान के संदर्भ म॑ ई क्षतिपूर्ति तंत्रऽ के बेहतर समझ स॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार स॑ जुड़लऽ प्लेयोट्रोपिक न्यूरोपैथोलॉजी के बारे म॑ महत्वपूर्ण जानकारी मिल॑ सकै छै ।
अंततः, हमरऽ आंकड़ा जीन अभिव्यक्ति, प्रोटीन संशोधन, आरू प्रोटीन गतिविधि के बीच जटिल अंतःक्रिया के कार्यात्मक परिणाम क॑ समझै लेली इमेजिंग तकनीक के उपयोगिता क॑ उजागर करै छै जे न्यूरॉनल माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता क॑ नियंत्रित करै छै । हमनें एएसडी के माइटोकॉन्ड्रिया घटक के बारे म॑ जानकारी प्राप्त करै लेली एक न्यूरॉनल सेल मॉडल म॑ माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन के मॉडलिंग करै लेली पीपीए के प्रयोग करलकै । पीपीए स॑ उपचारित SH-SY5Y कोशिका म॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान म॑ बदलाव देखलऽ गेलै: माइटोकॉन्ड्रिया छोटऽ आरू गोल होय गेलै, आरू TEM द्वारा देखलऽ जाय त॑ क्रिस्टा खराब परिभाषित होय गेलै । एमईएल विश्लेषण स॑ पता चलै छै कि ई परिवर्तन हल्का चयापचय तनाव के प्रतिक्रिया म॑ माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क क॑ बनाए रखै लेली विखंडन आरू संलयन घटना म॑ वृद्धि के साथ-साथ होय छै । एतबे नै, पीपीए माइटोकॉन्ड्रिया मेटाबोलिज्म आ होमियोस्टेसिस के ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन के काफी बाधित करैत अछि । हमनें cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, आरू OPA1 क॑ पीपीए तनाव स॑ बाधित प्रमुख माइटोकॉन्ड्रिया नियामक के रूप म॑ पहचान करलकै आरू माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान आरू कार्य म॑ पीपीए-प्रेरित परिवर्तन के मध्यस्थता म॑ भूमिका निभा सकै छै । जीन अभिव्यक्ति आरू प्रोटीन गतिविधि, स्थानीयकरण, आरू अनुवाद के बाद संशोधन म॑ पीपीए-प्रेरित अस्थायी परिवर्तनऽ के बेहतर विशेषता बताबै लेली भविष्य के अध्ययन के जरूरत छै । हमरऽ आंकड़ा माइटोकॉन्ड्रिया तनाव प्रतिक्रिया के मध्यस्थता करै वाला नियामक तंत्र के जटिलता आरू परस्पर निर्भरता क॑ उजागर करै छै आरू अधिक लक्षित यंत्रवत् अध्ययन लेली टीईएम आरू अन्य इमेजिंग तकनीक के उपयोगिता क॑ दर्शाबै छै ।
SH-SY5Y सेल लाइन (ECACC, 94030304-1VL) क॑ सिग्मा-एल्ड्रिच स॑ खरीदलऽ गेलऽ छेलै । SH-SY5Y कोशिका कें दुलबेको कें संशोधित ईगल कें माध्यम/एफ-12 पोषक तत्व मिश्रण (DMEM/F-12) आ एल-ग्लूटामाइन (SC09411, ScienCell) मे 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) आ 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (P4333-20ML, सिग्मा-एल्ड्रिच) 37 °C पर, 5% CO2। कोशिका क॑ 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए (15400054, थर्मोफिशर साइंटिफिक) के उपयोग करी क॑ 80% संगम तलक उपसंवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै, 300 ग्राम प॑ अपकेंद्रित्रित करलऽ गेलऽ छेलै आरू लगभग 7 × 105 कोशिका/एमएल के घनत्व प॑ प्लेट करलऽ गेलऽ छेलै । सब प्रयोग 19-22 के बीच अविभेदित SH-SY5Y कोशिका पर करलऽ गेलऽ छेलै । पीपीए एनएपी के रूप मे देल जाइत अछि। NaP पाउडर (CAS No. 137-40-6, रासायनिक सूत्र C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) कें गर्म MilliQ पानी मे 1 M कें सांद्रता मे घोल क 4 °C पर संग्रहित करूं. उपचार कें दिन, इ घोल कें 1 एम पीपीए सं 3 एमएम आ 5 एमएम पीपीए कें साथ सीरम-मुक्त माध्यम (एल-ग्लूटामाइन कें साथ डीएमईएम/एफ-12) मे पतला करूं. सब प्रयोगक कें लेल उपचार सांद्रता कोनों पीपीए (0 एमएम, नियंत्रण), 3 एमएम, आ 5 एमएम पीपीए नहि छल. प्रयोग कम स कम तीन जैविक प्रतिकृति मे कैल गेल।
SH-SY5Y कोशिका कें 5.5 × 105 कोशिका/एमएल कें दर सं 25 सेमी5 फ्लास्क मे बीज लगाएल गेलय आ 24 घंटा तइक बढ़ल गेलय. पीपीए उपचार कें 24 घंटा कें ऊष्मायन सं पहिले फ्लास्क मे मिला देल गेलय. सामान्य स्तनधारी ऊतक उपसंवर्धन प्रोटोकॉल (ऊपर वर्णित) कें पालन करयत कोशिका गोलीक कें संग्रहण करूं. कोशिका गोली कें 100 μl 2.5% ग्लूटारएलडीहाइड, 1× पीबीएस मे पुन: निलंबित करूं आ प्रसंस्करण तइक 4 °C पर संग्रहित करूं. SH-SY5Y कोशिका क॑ संक्षेप म॑ अपकेंद्रित्रित करलऽ गेलऽ छेलै ताकि कोशिका क॑ गोली बन॑ सक॑ आरू 2.5% ग्लूटारएलडीहाइड, 1× पीबीएस घोल क॑ हटाय सक॑ । आसुत जल मे तैयार 4% अगरोज जेल मे तलछट कें पुनः निलंबित करूं (अगरॉज आ तलछट कें आयतन कें अनुपात 1:1 छै)। अगरोज के टुकड़ा क॑ सपाट प्लेट प॑ ग्रिड प॑ रखलऽ गेलऽ छेलै आरू उच्च दबाव प॑ फ्रीज करै स॑ पहल॑ १-हेक्साडीसीन स॑ लेपित करलऽ गेलऽ छेलै । नमूनाक कें 100% सूखा एसीटोन मे -90 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा तइक जमल गेलय. तखन तापमान -80°C तक बढ़ा देल गेल आ 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड आ 0.1% ग्लूटारएलडीहाइड के घोल मिलाओल गेल । नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा तक संग्रहित कैल गेल। एकरऽ बाद धीरे-धीरे तापमान क॑ कई दिन तलक बढ़ा क॑ कमरा केरऽ तापमान करी देलऽ गेलै: – ८० डिग्री सेल्सियस स॑ – २४ घंटा तलक – ५० डिग्री सेल्सियस, २४ घंटा तलक – ३० डिग्री सेल्सियस, २४ घंटा तलक – १० डिग्री सेल्सियस आरू अंततः कमरा केरऽ तापमान प॑ । तापमान।
क्रायोजेनिक तैयारी के बाद, नमूना क॑ राल स॑ संसेचित करलऽ गेलऽ छेलै आरू अल्ट्राथिन खंड (∼100 एनएम) क॑ लीका रेइचेर्ट अल्ट्राकटएस अल्ट्रामाइक्रोटोम (लेइका माइक्रोसिस्टम्स) के उपयोग करी क॑ बनालऽ गेलऽ छेलै । खंडक कें 2% यूरेनाइल एसीटेट आ सीसा साइट्रेट सं रंगल गेलय. नमूना क॑ २०० केवी (लैब६ ट्रांसमीटर) प॑ काम करै वाला एफईआई टेकनाई २० ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (थर्मोफिशर (पहिने एफईआई), आइंडहोवेन, नीदरलैंड) आरू ट्राइडियम ऊर्जा फिल्टर स॑ लैस गैटन सीसीडी कैमरा (गटन, यूके) के उपयोग करी क॑ देखलऽ गेलऽ छेलै ।
प्रत्येक तकनीकी प्रतिकृति म॑ कम स॑ कम २४ एकल कोशिका छवि प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा स॑ कुल २६६ छवि छेलै । सब छवि के विश्लेषण ब्याज क्षेत्र (आरओआई) मैक्रो आरू माइटोकॉन्ड्रिया मैक्रो के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । माइटोकॉन्ड्रिया मैक्रो प्रकाशित विधियऽ17,31,32 प॑ आधारित छै आरू फिजी/इमेजJ69 म॑ टीईएम छवि केरऽ अर्ध-स्वचालित बैच प्रोसेसिंग के अनुमति दै छै । संक्षेप म॑ : छवि क॑ रोलिंग बॉल बैकग्राउंड सबट्रैक्शन (60 पिक्सेल त्रिज्या) आरू एफएफटी बैंडपास फिल्टर (क्रमशः 60 आरू 8 पिक्सेल ऊपरी आरू निचला सीमा के उपयोग करी क॑) आरू 5% के अभिविन्यास सहिष्णुता के साथ ऊर्ध्वाधर रेखा दमन के उपयोग करी क॑ उल्टा आरू उल्टा करलऽ जाय छै । संसाधित छवि कें स्वचालित रूप सं अधिकतम एन्ट्रोपी एल्गोरिदम कें उपयोग सं थ्रेशोल्ड कैल जायत छै आ एकटा बाइनरी मास्क उत्पन्न कैल जायत छै. कच्चा टीईएम छवि म॑ मैन्युअल रूप स॑ चुनलऽ गेलऽ आरओआई स॑ जुड़लऽ छवि क्षेत्र क॑ निकाललऽ गेलऽ छेलै, जेकरा म॑ माइटोकॉन्ड्रिया के विशेषता छेलै आरू प्लाज्मा झिल्ली आरू अन्य उच्च-विपरीत क्षेत्र क॑ बाहर करलऽ गेलऽ छेलै । प्रत्येक निष्कर्षित आरओआई के लेलऽ, 600 पिक्सेल स॑ बड़ऽ बाइनरी कणऽ के विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै, आरू कण क्षेत्र, परिधि, प्रमुख आरू छोटऽ अक्ष, फेरेट व्यास, गोलाई, आरू परिपत्रता क॑ फिजी/इमेजजे केरऽ अंतर्निहित मापन कार्यऽ के उपयोग करी क॑ मापलऽ गेलऽ छेलै । मेरिल, फ्लिप्पो, आरू स्ट्रैक (2017) के बाद, क्षेत्र 2, कण पहलू अनुपात (मुख्य स॑ माइनर अक्ष अनुपात), आरू आकार कारक (एफएफ) के गणना ई आंकड़ऽ स॑ करलऽ गेलऽ छेलै, जहाँ एफएफ = परिधि 2/4pi x क्षेत्रफल । पैरामेट्रिक सूत्र केरऽ परिभाषा मेरिल, फ्लिप्पो, आरू स्ट्रैक (2017) म॑ मिल॑ सकै छै । उल्लिखित मैक्रो गिटहब पर उपलब्ध छै (देखूं डाटा उपलब्धता कथन)। औसतन, प्रति पीपीए उपचार लगभग 5,600 कणक कें विश्लेषण करल गेलय, कुल लगभग 17,000 कणक कें लेल (डेटा नहि दिखायल गेल छै) ।
SH-SH5Y कोशिका क॑ 8-कक्ष संस्कृति बर्तन (ThermoFisher, #155411) म॑ रखलऽ गेलऽ छेलै ताकि रात भर आसंजन होय ​​सक॑ आरू ओकरा बाद TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) आरू Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) के साथ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । रंगाई-पोताई। 10 मिनट के वातावरण म॑ 405 एनएम आरू 561 एनएम लेजर के उपयोग करी क॑ छवि प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै, आरू कच्चा छवि क॑ z-स्टैक के रूप म॑ प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ 10 छवि माइक्रोग्राफ छेलै जेकरा म॑ 12 बाद के समय बिंदु प॑ छवि फ्रेम के बीच 0.2 μm के az स्टेप छेलै । एलसीआई प्लान एपोक्रोमेट 100x/1.4 ऑयल डीआईसी एम27 लेंस के उपयोग करी क॑ कार्ल जेइस LSM780 ELYRA PS.1 सुपर-रिजोल्यूशन प्लेटफॉर्म (कार्ल जेइस, ओबरकोचेन, जर्मनी) के उपयोग करी क॑ छवि एकत्रित करलऽ गेलऽ छेलै । इमेजजे म॑ छवियऽ के विश्लेषण एक पूर्व वर्णित पाइपलाइन आरू इमेजजे प्लगइन के उपयोग करी क॑ संलयन आरू विखंडन घटना, माइटोकॉन्ड्रिया संरचना के औसत संख्या, आरू औसत माइटोकॉन्ड्रिया आयतन प्रति कोशिका33 क॑ मापै लेली करलऽ गेलऽ छेलै । MEL मैक्रो GitHub पर उपलब्ध छै (देखूं डाटा उपलब्धता कथन)।
SH-SY5Y कोशिका क॑ छह-वेल प्लेट म॑ 0.3 × 106 कोशिका/एमएल के घनत्व प॑ उपचार स॑ पहल॑ 24 घंटा तलक उगालऽ गेलऽ छेलै । आरएनए क॑ क्विक-आरएनए TM Miniprep प्रोटोकॉल (ZR R1055, Zymo Research) के उपयोग करी क॑ मामूली संशोधन के साथ निकाललऽ गेलऽ छेलै: हटाबै स॑ पहल॑ हर कुँआ म॑ 300 μl आरएनए लाइसिस बफर जोड़लऽ गेलऽ छेलै आरू हर नमूना क॑ 30 μl डीएनएज/आरएनएज इल्यूशन के साथ अंतिम चरण के रूप म॑ लाइस करलऽ गेलऽ छेलै । -मुक्त पानि। सब नमूना के मात्रा आरू गुणवत्ता के जांच नैनोड्रॉप एनडी-1000 यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । कोशिका लाइसेट स॑ कुल प्रोटीन 200 μl RIPA लाइसिस बफर के उपयोग स॑ प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै, आरू प्रोटीन एकाग्रता क॑ ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख70 के उपयोग स॑ मात्रा निर्धारित करलऽ गेलऽ छेलै ।
cDNA संश्लेषण निर्माता केरऽ निर्देश के अनुसार TetroTM cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) के उपयोग करी क॑ कुछ संशोधन के साथ करलऽ गेलऽ छेलै । कुल आरएनए के 0.7 स॑ 1 μg के उपयोग करी क॑ 20-μl प्रतिक्रिया म॑ cDNA के संश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै । प्राइमर क॑ पहिने प्रकाशित शोध पत्र 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (तालिका S1) स॑ चुनलऽ गेलऽ छेलै आरू साथ म॑ देलऽ गेलऽ जांच क॑ इंटीग्रेटेड डीएनए टेक्नोलॉजीज केरऽ प्राइमरक्वेस्ट टूल के उपयोग करी क॑ डिजाइन करलऽ गेलऽ छेलै । रुचि के सब जीन क॑ न्यूक्लियर बी टू एम जीन म॑ सामान्य करलऽ गेलऽ छेलै । STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC आरू OPA1 केरऽ जीन अभिव्यक्ति क॑ आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा मापलऽ गेलऽ छेलै । मास्टर मिक्स म॑ LUNA Taq पॉलीमरेज़ (M3003L, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स), 10 μM फॉरवर्ड आरू रिवर्स प्राइमर, cDNA, आरू पीसीआर-ग्रेड पानी शामिल छेलै जेकरा स॑ हर प्रतिक्रिया लेली 10 μL के अंतिम आयतन मिललै । विभाजन आरू विखंडन जीन (DRP1, MFN1/2) केरऽ अभिव्यक्ति क॑ TaqMan मल्टीप्लेक्स परख के उपयोग करी क॑ मापलऽ गेलऽ छेलै । लूना यूनिवर्सल प्रोब qPCR मास्टर मिक्स (M3004S, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) के उपयोग निर्माता के निर्देश के अनुसार छोट-मोट संशोधन के साथ करलऽ गेलऽ छेलै । मल्टीप्लेक्स आरटी-क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स म॑ 1X LUNA Taq पॉलीमरेज़, 10 μM फॉरवर्ड आरू रिवर्स प्राइमर, 10 μM प्रोब, cDNA, आरू पीसीआर-ग्रेड पानी शामिल छै, जेकरऽ परिणामस्वरूप हर प्रतिक्रिया लेली 20 μL के अंतिम आयतन मिलै छै । आरटी-क्यूपीसीआर रोटर-जीन क्यू 6-प्लेक्स (QIAGEN RG—सीरियल नंबर: R0618110) के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै । साइकिल चलाबय कें स्थिति तालिका S1 मे दिखायल गेल छै. सब सीडीएनए नमूना क॑ तीन प्रति म॑ प्रवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै आरू दस गुना पतलापन केरऽ श्रृंखला के उपयोग करी क॑ एक मानक वक्र पैदा करलऽ गेलऽ छेलै । चक्र थ्रेशोल्ड मानक विचलन (Ct) >0.5 वाला तीन प्रतिलिपि नमूनाक मे आउटलइयर कें विश्लेषण सं हटा देल गेलय ताकि डाटा पुन: प्रजनन क्षमता सुनिश्चित कैल जा सकय30,72. सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति के गणना 2-ΔΔCt79 विधि के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै ।
प्रोटीन नमूना (60 μg) क॑ 2:1 अनुपात म॑ लैम्मली लोडिंग बफर स॑ मिला क॑ 12% बेरंग प्रोटीन जेल (बायो-रैड #1610184) प॑ चलालऽ गेलऽ छेलै । प्रोटीन क॑ ट्रांस-ब्लॉट टर्बो सिस्टम (#170-4155, बायो-रैड) के उपयोग करी क॑ पीवीडीएफ (पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड) झिल्ली (#170-84156, बायो-रैड) म॑ स्थानांतरित करलऽ गेलऽ छेलै । झिल्ली क॑ अवरुद्ध करी क॑ उचित प्राथमिक एंटीबॉडी (OPA1, MFN1, MFN2, आरू DRP1) (पतला 1:1000) स॑ 48 घंटा तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा बाद द्वितीयक एंटीबॉडी (1:10,000) स॑ 1 घंटा तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । तखन झिल्ली क॑ क्लैरिटी वेस्टर्न ईसीएल सब्सट्रेट (#170-5061, बायो-रैड) के उपयोग करी क॑ इमेजिंग करलऽ गेलऽ छेलै आरू बायो-रैड केमिडॉक एमपी सिस्टम के उपयोग करी क॑ रिकॉर्ड करलऽ गेलऽ छेलै । वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लेल इमेजलैब संस्करण 6.1 के उपयोग कैल गेल छल. मूल जेल आ ब्लॉट चित्र S1 मे दिखायल गेल छै. एंटीबॉडी कें जानकारी तालिका S2 मे देल गेल छै.
डाटा सेट कें कम सं कम तीन स्वतंत्र नमूनाक कें औसत आ औसत कें मानक त्रुटि (एसईएम) कें रूप मे प्रस्तुत कैल गेल छै. एक गाउसी वितरण आरू समान मानक विचलन मानय आरू विश्लेषणऽ के साथ आगू बढ़ै स॑ पहल॑ शापिरो-विल्क्स परीक्षण (जब तलक कि अन्यथा नै कहलऽ गेलऽ होय) के उपयोग करी क॑ डाटा सेट के सामान्यता के परीक्षण करलऽ गेलऽ छेलै । फिशर केरऽ एमईएल एलएसडी (पी < 0.05), एकतरफा एनोवा (उपचार बनाम नियंत्रण औसत), आरू डनेट केरऽ बहु तुलना परीक्षण के उपयोग करी क॑ डाटा सेट के विश्लेषण के अलावा महत्व (पी < 0.05) के उपयोग करलऽ जाय छै । महत्वपूर्ण पी मान ग्राफ मे *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 के रूप मे दिखाया गया है | सबटा सांख्यिकीय विश्लेषण आ ग्राफ ग्राफपैड प्रिज्म 9.4.0 कें उपयोग सं कैल गेलय आ उत्पन्न कैल गेलय.
TEM छवि विश्लेषण कें लेल फिजी/ImageJ मैक्रो GitHub पर सार्वजनिक रूप सं उपलब्ध छै: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. माइटोकॉन्ड्रिया इवेंट लोकेटर (MEL) मैक्रो सार्वजनिक रूप स॑ गिटहब प॑ उपलब्ध छै: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin ।
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