हम पहिने रिपोर्ट केने रही जे लिवर फाइब्रोसिस के मरीज में आंत सं निकलल ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट इंडोल-3-प्रोपिओनिक एसिड (IPA) के सीरम स्तर कम रहैत अछि. ई अध्ययन म॑ हमन॑ सीरम आईपीए स्तर के संबंध म॑ मोटापा वाला यकृत म॑ ट्रांसक्रिप्टोम आरू डीएनए मिथाइलोम के जांच करलकै, साथ ही साथ इन विट्रो म॑ यकृत स्टेलेट कोशिका (एचएससी) के फेनोटाइपिक निष्क्रियता क॑ प्रेरित करै म॑ आईपीए के भूमिका के जांच करलकै ।
अध्ययन म॑ टाइप 2 डायबिटीज मेलिटस (T2DM) (उम्र 46.8 ± 9.3 साल; बीएमआई: 42.7 ± 5.0 किलोग्राम/मीटर2) के बिना 116 मोटापा वाला मरीज शामिल छेलै, जेकरा कुओपियो बेरियाट्रिक सर्जरी सेंटर (KOBS) म॑ बेरियाट्रिक सर्जरी करलऽ गेलऽ छेलै । परिसंचारी आईपीए स्तर क॑ लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) द्वारा मापलऽ गेलऽ छेलै, लिवर ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण कुल आरएनए अनुक्रमण द्वारा करलऽ गेलऽ छेलै, आरू डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण इन्फिनियम ह्यूमनमिथाइलेशन450 बीडचिप के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । मानव यकृत तारकीय कोशिका (LX-2) के उपयोग इन विट्रो प्रयोग के लेल करलऽ गेलऽ छेलै ।
सीरम आईपीए स्तर यकृत म॑ एपोप्टोटिक, माइटोफेजिक, आरू दीर्घायु मार्ग म॑ शामिल जीन के अभिव्यक्ति के साथ सहसंबंधित छेलै । एकेटी सेरीन/थ्रेओनिन किनेज़ 1 (AKT1) जीन लिवर ट्रांसक्रिप्ट आरू डीएनए मिथाइलेशन प्रोफाइल म॑ सबसें प्रचुर आरू प्रबल इंटरैक्टिंग जीन छेलै । आईपीए उपचार न॑ एपोप्टोसिस क॑ प्रेरित करलकै, माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन म॑ कमी ​​करलकै, आरू एलएक्स-2 कोशिका केरऽ फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस आरू जीवित रहना क॑ नियंत्रित करै लेली जानलऽ जाय वाला जीनऽ के अभिव्यक्ति क॑ संतुलित करी क॑ कोशिका आकृति विज्ञान आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता म॑ बदलाव करलकै ।
एक साथ लेलऽ जाय त॑ ई आंकड़ा ई बात के समर्थन करै छै कि आईपीए के संभावित चिकित्सीय प्रभाव छै आरू एपोप्टोसिस क॑ प्रेरित करी सकै छै आरू एचएससी फेनोटाइप क॑ निष्क्रिय अवस्था के तरफ शिफ्ट करी सकै छै, जेकरा स॑ एचएससी सक्रियण आरू माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय म॑ हस्तक्षेप करी क॑ लिवर फाइब्रोसिस क॑ रोकै के संभावना बढ़ी जाय छै ।
मोटापा आ मेटाबोलिक सिंड्रोम कें प्रसार मेटाबोलिक रूप सं जुड़ल फैटी लिवर रोग (MASLD) कें बढ़ैत घटना सं जुड़ल छै; ई बीमारी सामान्य आबादी के 25% सं 30% लोक के प्रभावित करैत अछि [1] । MASLD एटियलजि केरऽ मुख्य परिणाम लिवर फाइब्रोसिस छै, जे एक गतिशील प्रक्रिया छै जेकरऽ विशेषता छै रेशेदार बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ECM) केरऽ लगातार संचय [2] । यकृत फाइब्रोसिस में शामिल मुख्य कोशिका यकृत तारकीय कोशिका (HSCs) छै, जे चारि ज्ञात फेनोटाइप प्रदर्शित करै छै: शांत, सक्रिय, निष्क्रिय, आरू बुढ़ापा [3, 4] । एचएससी क॑ सक्रिय करलऽ जाब॑ सकै छै आरू एक शांत रूप स॑ उच्च ऊर्जा केरऽ मांग वाला प्रजनन फाइब्रोब्लास्ट जैसनऽ कोशिका म॑ ट्रांसडिफरेंस करलऽ जाय सकै छै, जेकरा म॑ α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (α-SMA) आरू टाइप I कोलेजन (Col-I) केरऽ अभिव्यक्ति बढ़ी जाय छै [5, 6] । लिवर फाइब्रोसिस रिवर्सल कें दौरान, सक्रिय एचएससी एपोप्टोसिस या निष्क्रियता कें माध्यम सं समाप्त भ जायत छै. ई प्रक्रिया म॑ फाइब्रोजेनिक जीन केरऽ डाउनरेगुलेशन आरू प्रोसर्वाइवल जीन (जैना कि NF-κB आरू PI3K/Akt सिग्नलिंग मार्ग) केरऽ मॉड्यूलेशन [7, 8], के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रिया डायनामिक्स आरू फंक्शन म॑ बदलाव भी शामिल छै [9] ।
आंत म॑ उत्पादित ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट इंडोल-3-प्रोपिओनिक एसिड (IPA) केरऽ सीरम स्तर म॑ कमी ​​पाबै गेलऽ छै, जेकरा म॑ MASLD सहित मानव मेटाबोलिक बीमारी म॑ कमी ​​आबी गेलऽ छै [10-13] । आईपीए आहार फाइबर के सेवन स॑ जुड़लऽ छै, अपनऽ एंटीऑक्सीडेंट आरू एंटी-इंफ्लेमेटरी प्रभाव लेली जानलऽ जाय छै, आरू आहार-प्रेरित गैर-मद्यपान स्टीटोहेपेटाइटिस (NASH) फेनोटाइप क॑ इन विवो आरू इन विट्रो म॑ क्षीण करी दै छै [11-14] । किछु सबूत हमरऽ पिछला अध्ययन स॑ मिलै छै, जेकरा म॑ ई सिद्ध करलऽ गेलऽ छै कि कुओपियो बेरियाट्रिक सर्जरी अध्ययन (KOBS) म॑ लिवर फाइब्रोसिस के मरीजऽ म॑ सीरम आईपीए के स्तर कम छेलै, जेकरा म॑ लिवर फाइब्रोसिस नै छेलै । एकरऽ अलावा, हमन॑ देखैलकै कि आईपीए उपचार जीनऽ के अभिव्यक्ति क॑ कम करी सकै छै जे मानव यकृत स्टेलेट सेल (LX-2) मॉडल म॑ कोशिका आसंजन, कोशिका प्रवासन आरू हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल सक्रियण के शास्त्रीय मार्कर छै आरू एक संभावित हेपेटोप्रोटेक्टिव मेटाबोलाइट छै [15] । लेकिन ई स्पष्ट नै छै कि आईपीए एचएससी एपोप्टोसिस आरू माइटोकॉन्ड्रिया बायोएनर्जेटिक्स क॑ सक्रिय करी क॑ लिवर फाइब्रोसिस रिग्रेशन क॑ कोना प्रेरित करै छै ।
यहाँ, हम ई दर्शाबै छियै कि सीरम आईपीए मोटापा लेकिन गैर-टाइप 2 डायबिटीज (KOBS) व्यक्ति के यकृत म॑ एपोप्टोसिस, माइटोफेजी, आरू दीर्घायु के मार्ग स॑ समृद्ध जीन के अभिव्यक्ति स॑ जुड़लऽ छै । एकरऽ अलावा, हमनें पाया कि आईपीए निष्क्रियता मार्ग के माध्यम स॑ सक्रिय हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) केरऽ निकासी आरू अपघटन क॑ प्रेरित करी सकै छै । ई परिणाम आईपीए लेली एगो नवीन भूमिका के खुलासा करै छै, जेकरा स॑ ई लिवर फाइब्रोसिस रिग्रेशन क॑ बढ़ावा दै लेली एगो संभावित चिकित्सीय लक्ष्य बनी जाय छै ।
कोब्स कोहोर्ट में एकटा पूर्व अध्ययन में पता चलल जे लिवर फाइब्रोसिस के रोगी में बिना लिवर फाइब्रोसिस के मरीज के तुलना में कम परिसंचारी आईपीए के स्तर छल [15] । टाइप 2 मधुमेह के संभावित भ्रमित करय वाला प्रभाव के बाहर करय लेल, हम अध्ययन आबादी के रूप में चल रहल केओबीएस अध्ययन सं टाइप 2 मधुमेह (औसत उम्र ± एसडी: 46.8 ± 9.3 वर्ष; बीएमआई: 42.7 ± 5.0 किलोग्राम/एम2) (तालिका 1) के बिना 116 मोटापा रोगी के भर्ती केलहुं [16]. सब प्रतिभागी न॑ लिखित सूचित सहमति देलकै आरू अध्ययन प्रोटोकॉल क॑ हेलसिंकी केरऽ घोषणापत्र (54/2005, 104/2008 आरू 27/2010) के अनुसार नॉर्थ सावो काउंटी अस्पताल केरऽ नैतिकता समिति द्वारा मंजूरी देलऽ गेलै ।
बेरियाट्रिक सर्जरी के दौरान लिवर बायोप्सी नमूना प्राप्त कयल गेल आ अनुभवी पैथोलॉजिस्ट द्वारा पहिने वर्णित मानदंडक अनुसार ऊतकीय आकलन कयल गेल [17, 18] । आकलन मानदंडक कें संक्षेप मे पूरक तालिका S1 मे देल गेल छै आ एकर वर्णन पहिने कैल गेल छै [19].
उपवास सीरम नमूना क॑ मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण (n = 116) लेली अनलक्षित तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) द्वारा विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै । नमूनाक कें विश्लेषण यूएचपीएलसी-क्यूटीओएफ-एमएस प्रणाली (1290 एलसी, 6540 क्यूटीओएफ-एमएस, एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, वाल्डब्रोन, कार्लस्रूहे, जर्मनी) कें उपयोग सं कैल गेलय जैना की पहिने वर्णित छै19. आइसोप्रोपाइल अल्कोहल (आईपीए) केरऽ पहचान रिटेन टाइम आरू शुद्ध मानक के साथ एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम केरऽ तुलना प॑ आधारित छेलै । आगू के सब विश्लेषण में आईपीए सिग्नल तीव्रता (पीक एरिया) पर विचार कयल गेल छल [20] ।
पूरा यकृत आरएनए अनुक्रमण Illumina HiSeq 2500 के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै आरू डाटा क॑ पूर्व-संसाधित करलऽ गेलऽ छेलै जैसनऽ कि पहले वर्णित छेलै [19, 21, 22] । हमनें माइटोमाइनर 4.0 डाटाबेस स॑ चुनलऽ गेलऽ 1957 जीन के उपयोग करी क॑ माइटोकॉन्ड्रिया फंक्शन/बायोजेनेसिस क॑ प्रभावित करै वाला ट्रांसक्रिप्ट के लक्षित विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण करलकै [ 23 ]. लिवर डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ वू ही पद्धति के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै जे पहले वर्णित छेलै [24, 25] ।
मानव यकृत तारकीय कोशिका (LX-2) क॑ प्रो स्टीफनो रोमियो द्वारा दयालुता स॑ उपलब्ध कराय देलऽ गेलऽ छेलै आरू डीएमईएम/एफ12 माध्यम (बायोवेस्ट, एल0093-500, 1% पेन/स्ट्रेप; लोन्जा, डीई17-602ई, 2% एफबीएस; गिबको, 10270-106) म॑ संवर्धित आरू बनाए रखलऽ गेलऽ छेलै । आईपीए केरऽ कामकाजी खुराक के चयन करै लेली एलएक्स-2 कोशिका क॑ डीएमईएम/एफ12 माध्यम म॑ 24 घंटा तलक आईपीए केरऽ अलग-अलग सांद्रता (10 μM, 100 μM आरू 1 mM; सिग्मा, 220027) स॑ उपचारित करलऽ गेलऽ छेलै । एकरऽ अलावा, आईपीए केरऽ एचएससी क॑ निष्क्रिय करै के क्षमता के जांच करै लेली एलएक्स-2 कोशिका क॑ सीरम-मुक्त माध्यम म॑ 5 एनजी/एमएल टीजीएफ-बीटा1 (आर एंड डी सिस्टम, 240-बी-002/सीएफ) आरू 1 एमएम आईपीए स॑ 24 घंटा तलक सह-उपचारित करलऽ गेलऽ छेलै । संबंधित वाहन नियंत्रण के लेलऽ, टीजीएफ-β1 उपचार लेली 0.1% बीएसए युक्त 4 एनएम एचसीएल आरू आईपीए उपचार लेली 0.05% डीएमएसओ के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै, आरू संयोजन उपचार लेली दूनू के उपयोग एक साथ करलऽ गेलऽ छेलै ।
एपोप्टोसिस कें आकलन निर्माता कें निर्देशक कें अनुसार 7-एएडी (बायोलेजेंड, सैन डिएगो, सीए, अमेरिका, कैट # 640922) कें साथ एफआईटीसी एनेक्सिन वी एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट कें उपयोग सं करल गेलय छेलै. संक्षेप म॑, एलएक्स-2 (1 × 105 कोशिका/कुएं) क॑ 12-वेल प्लेट म॑ रात भर संवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै आरू ओकरा बाद आईपीए या आईपीए आरू टीजीएफ-बीटा1 केरऽ कई खुराक स॑ उपचारित करलऽ गेलऽ छेलै । अगिला दिन, फ्लोटिंग आरू आश्रित कोशिका क॑ एकत्रित करी क॑ ट्राइप्सिनाइज करलऽ गेलै, पीबीएस स॑ धोलऽ गेलै, एनेक्सिन वी बाइंडिंग बफर म॑ पुनः निलंबित करलऽ गेलै, आरू एफआईटीसी-एनेक्सिन वी आरू 7-एएडी स॑ 15 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलै ।
जीवित कोशिका म॑ माइटोकॉन्ड्रिया क॑ माइटोट्रैकर TM रेड सीएमएक्सआरओएस (एमटीआर) (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कार्लस्बैड, सीए) के उपयोग करी क॑ ऑक्सीडेटिव गतिविधि के लेलऽ रंगलऽ गेलऽ छेलै । एमटीआर परख के लेलऽ एलएक्स-2 कोशिका क॑ आईपीए आरू टीजीएफ-β1 के साथ बराबर घनत्व प॑ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । 24 घंटा के बाद, जीवित कोशिका क॑ ट्राइप्सिनाइज करलऽ गेलऽ छेलै, पीबीएस स॑ धोलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद 100 μM एमटीआर स॑ सीरम-मुक्त माध्यम म॑ 37 डिग्री सेल्सियस प॑ 20 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै जैसनऽ कि पहले वर्णित छै [ 26 ]. जीवित कोशिका आकृति विज्ञान विश्लेषण के लेलऽ कोशिका आकार आरू कोशिका द्रव्य जटिलता के विश्लेषण क्रमशः फॉरवर्ड स्कैटर (FSC) आरू साइड स्केटर (SSC) पैरामीटर के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै ।
सब डाटा (30,000 घटना) नोवोसाइट क्वांटियन (एजिलेंट) कें उपयोग सं प्राप्त करल गेलय छेलै आ नोवोएक्सप्रेस® 1.4.1 या फ्लोजो वी.10 सॉफ्टवेयर कें उपयोग सं विश्लेषण करल गेलय छेलै.
निर्माता केरऽ निर्देश के अनुसार सीहॉर्स एक्सएफ सेल माइटो तनाव स॑ लैस सीहॉर्स एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर (एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) के उपयोग करी क॑ वास्तविक समय म॑ ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) आरू बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) क॑ मापलऽ गेलऽ छेलै । संक्षेप म॑, 2 × 104 LX-2 कोशिका/कुएं क॑ XF96 कोशिका संवर्धन प्लेट प॑ बीज लगाय देलऽ गेलऽ छेलै । रात भर ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं क॑ आइसोप्रोपानोल (IPA) आरू TGF-β1 (पूरक विधि 1) स॑ उपचारित करलऽ गेलऽ छेलै । सीहॉर्स एक्सएफ वेव सॉफ्टवेयर कें उपयोग सं आंकड़ा विश्लेषण करल गेलय छेलै, जेकरा मे सीहॉर्स एक्सएफ सेल ऊर्जा फेनोटाइप परीक्षण रिपोर्ट जनरेटर शामिल छै. एहि सं बायोएनर्जेटिक हेल्थ इंडेक्स (BHI) केर गणना कयल गेल [27] ।
कुल आरएनए क॑ सीडीएनए म॑ लिपिबद्ध करलऽ गेलऽ छेलै । विशिष्ट विधिक लेल संदर्भ [15] देखू। मानव 60S राइबोसोमल अम्लीय प्रोटीन पी0 (RPLP0) आरू साइक्लोफिलिन ए1 (PPIA) mRNA स्तर क॑ संरचनात्मक जीन नियंत्रण के रूप म॑ प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । QuantStudio 6 प्रो रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर, लैंडस्मीयर, नीदरलैंड) क॑ TaqManTM फास्ट एडवांस्ड मास्टर मिक्स किट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) या सेंसिफास्ट SYBR Lo-ROX किट (बायोलाइन, बायो 94050) के साथ प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै, आरू सापेक्षिक जीन अभिव्यक्ति गुना के गणना तुलनात्मक Ct मान चक्रीय पैरामीटर (ΔΔCt) आरू के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै ∆∆Ct विधि। प्राइमर्स कें विवरण पूरक तालिका S2 आ S3 मे देल गेल छै.
न्यूक्लियर डीएनए (ncDNA) आरू माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए (mtDNA) क॑ DNeasy ब्लड आरू टिश्यू किट (Qiagen) के उपयोग करी क॑ निकाललऽ गेलऽ छेलै जैसनऽ कि पहले वर्णित छै [28] । mtDNA केरऽ सापेक्षिक मात्रा केरऽ गणना तीन परमाणु डीएनए क्षेत्र (mtDNA/ncDNA) केरऽ ज्यामितीय औसत स॑ प्रत्येक लक्ष्य mtDNA क्षेत्र केरऽ अनुपात के गणना करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै, जैसनऽ कि पूरक विधि 2 म॑ विस्तार स॑ बतैलऽ गेलऽ छै ।mtDNA आरू ncDNA लेली प्राइमर केरऽ विवरण पूरक तालिका S4 म॑ उपलब्ध कराय देलऽ गेलऽ छै ।
जीवित कोशिका क॑ माइटोट्रैकर TM रेड सीएमएक्सआरोस (एमटीआर) (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कार्लस्बैड, सीए) स॑ रंगलऽ गेलऽ छेलै ताकि अंतरकोशिकीय आरू अंतःकोशिकीय माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क केरऽ कल्पना करलऽ जाय सक॑ । LX-2 कोशिका (1 × 104 कोशिका / कुएं) क॑ संगत ग्लास-बॉटम संवर्धन प्लेट (Ibidi GmbH, Martinsried, जर्मनी) म॑ ग्लास स्लाइड प॑ संवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै । 24 घंटा के बाद, जीवित LX-2 कोशिका क॑ 100 μM MTR स॑ 37 °C प॑ 20 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै आरू कोशिका नाभिक क॑ DAPI (1 μg/ml, सिग्मा-एल्ड्रिच) स॑ रंगलऽ गेलऽ छेलै जैसनऽ कि पहले वर्णित छेलै [29] । माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क क॑ 63×NA 1.3 उद्देश्य के उपयोग करी क॑ 5% CO2 के साथ आर्द्र वातावरण म॑ 37 °C प॑ जेइस एलएसएम 800 कॉनफोकल मॉड्यूल स॑ लैस जेइस एक्सियो ऑब्जर्वर उल्टा सूक्ष्मदर्शी (कार्ल जेइस माइक्रोइमेजिंग जीएमबीएच, जेना, जर्मनी) के उपयोग करी क॑ दृश्यमान करलऽ गेलऽ छेलै । हम प्रत्येक नमूना प्रकार के लेल दस जेड-सीरीज छवि प्राप्त केलहुं। प्रत्येक जेड-श्रृंखला मे 30 खंड होइत अछि, जाहि मे प्रत्येक खंडक मोटाई 9.86 माइक्रोन होइत अछि । प्रत्येक नमूना के लेलऽ, दस अलग-अलग दृष्टि क्षेत्रऽ के छवि जेन 2009 सॉफ्टवेयर (कार्ल जेइस माइक्रोइमेजिंग जीएमबीएच, जेना, जर्मनी) के उपयोग करी क॑ प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै, आरू पूरक विधि 3 म॑ विस्तृत पैरामीटर के अनुसार इमेजजे सॉफ्टवेयर (v1.54d) [30, 31] के उपयोग करी क॑ माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै ।
कोशिका क॑ 0.1 एम फॉस्फेट बफर म॑ 2% ग्लूटारएलडीहाइड स॑ फिक्स करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा बाद 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड घोल (सिग्मा एल्ड्रिच, एमओ, अमेरिका) स॑ फिक्स करलऽ गेलऽ छेलै, धीरे-धीरे एसीटोन (मर्क, डार्मस्टैड, जर्मनी) स॑ निर्जलीकरण करलऽ गेलऽ छेलै, आरू अंततः इपोक्सी राल म॑ एम्बेडेड करलऽ गेलऽ छेलै । अल्ट्राथिन खंड तैयार करलऽ गेलऽ छेलै आरू 1% यूरेनिल एसीटेट (मर्क, डार्मस्टैड, जर्मनी) आरू 1% सीसा साइट्रेट (मर्क, डार्मस्टैड, जर्मनी) स॑ रंगलऽ गेलऽ छेलै । अल्ट्रास्ट्रक्चरल इमेज जेईएम 2100एफ एक्सआईआई ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (जेईओएल लिमिटेड, टोक्यो, जापान) के उपयोग स॑ 80 केवी के त्वरक वोल्टेज प॑ प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै ।
24 घंटा तलक आईपीए स॑ उपचारित एलएक्स-2 कोशिका केरऽ आकृति विज्ञान क॑ जेइस इन्वर्टेड लाइट माइक्रोस्कोप (जेइस एक्सियो वर्ट.ए1 आरू एक्सियोकैम एमआरएम, जेना, जर्मनी) के उपयोग करी क॑ 50x आवर्धन प॑ फेज-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै ।
नैदानिक ​​आंकड़ा औसत ± मानक विचलन या माध्य (इंटरक्वार्टाइल रेंज: आईक्यूआर) के रूप मे व्यक्त कैल गेल छल । तीनों अध्ययन समूहक कें बीच अंतर कें तुलना करय कें लेल विचरण (निरंतर चर) या χ2 परीक्षण (श्रेणीगत चर) कें एकतरफा विश्लेषण कें उपयोग करल गेलय छेलै. कई परीक्षण कें लेल सही करय कें लेल झूठा पॉजिटिव दर (एफडीआर) कें उपयोग करल गेलय छेलै, आ एफडीआर < 0.05 वाला जीन कें सांख्यिकीय रूप सं महत्वपूर्ण मानल गेलय. स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण के उपयोग आईपीए संकेत तीव्रता के साथ सीपीजी डीएनए मिथाइलेशन क॑ सहसंबंधित करै लेली करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा म॑ नाममात्र के पी मान (पी < 0.05) के रिपोर्ट करलऽ गेलऽ छेलै ।
पथ विश्लेषण 268 ट्रांसक्रिप्ट (नाममात्र पी < 0.01), 119 माइटोकॉन्ड्रिया सं जुड़ल ट्रांसक्रिप्ट (नाममात्र पी < 0.05), आ 3093 लिवर ट्रांसक्रिप्ट मे सं 4350 सीपीजी कें लेल वेब आधारित जीन सेट विश्लेषण उपकरण (WebGestalt) कें उपयोग सं कैल गेलय छेलै जे परिसंचारी सीरम आईपीए स्तर सं जुड़ल छल. मुक्त रूप स॑ उपलब्ध वेनी डीबी (संस्करण २.१.०) उपकरण के उपयोग ओवरलैपिंग जीन खोजै लेली करलऽ गेलऽ छेलै, आरू स्ट्रिंगडीबी (संस्करण ११.५) के उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया के कल्पना करै लेली करलऽ गेलऽ छेलै ।
एलएक्स-2 प्रयोग के लेलऽ नमूना के सामान्यता के परीक्षण डी'अगोस्टिनो-पियर्सन परीक्षण के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । कम स॑ कम तीन जैविक प्रतिकृति स॑ आंकड़ा प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै आरू बोनफेरोनी तदर्थ परीक्षण के साथ एकतरफा एनोवा के अधीन करलऽ गेलऽ छेलै । 0.05 स कम पी-वैल्यू कए सांख्यिकीय रूप स महत्वपूर्ण मानल गेल। आँकड़ा औसत ± एसडी के रूप म॑ प्रस्तुत करलऽ गेलऽ छै, आरू प्रयोगऽ के संख्या क॑ प्रत्येक आकृति म॑ दर्शायलऽ गेलऽ छै । सब विश्लेषण आरू ग्राफ विंडोज के लेलऽ ग्राफपैड प्रिज्म 8 सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, संस्करण 8.4.3, सैन डिएगो, अमेरिका) के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै ।
सबसँ पहिने, हम सीरम आईपीए स्तर के लिवर, पूरा शरीर, आ माइटोकॉन्ड्रिया ट्रांसक्रिप्ट के संग संबंध के जांच केलहुं. कुल ट्रांसक्रिप्ट प्रोफाइल म॑, सीरम आईपीए स्तर स॑ जुड़लऽ सबस॑ मजबूत जीन MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; माइटोजन-सक्रिय प्रोटीन किनेज़-सक्रिय प्रोटीन किनेज़ 3) छेलै; माइटोकॉन्ड्रिया स॑ संबंधित ट्रांसक्रिप्ट प्रोफाइल म॑, सबस॑ मजबूत संबद्ध जीन AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (अतिरिक्त फाइल 1 आरू अतिरिक्त फाइल 2) छेलै ।
तखन हम वैश्विक प्रतिलेख (n = 268; p <0.01) आरू माइटोकॉन्ड्रिया-संबद्ध प्रतिलेख (n = 119; p <0.05) के विश्लेषण करलकै, अंततः एपोप्टोसिस क॑ सबसे महत्वपूर्ण कैनोनिकल मार्ग (p = 0.0089) के रूप म॑ पहचान करलकै । सीरम आईपीए स्तर स॑ जुड़लऽ माइटोकॉन्ड्रिया ट्रांसक्रिप्ट के लेलऽ, हमन॑ एपोप्टोसिस (FDR = 0.00001), माइटोफेजी (FDR = 0.00029), आरू TNF संकेत मार्ग (FDR = 0.000006) (चित्र 1A, तालिका 2, आरू पूरक चित्र 1A-B) प॑ ध्यान केंद्रित करलकै ।
सीरम आईपीए स्तर के साथ संबद्ध मानव यकृत म॑ वैश्विक, माइटोकॉन्ड्रिया स॑ जुड़लऽ ट्रांसक्रिप्ट, आरू डीएनए मिथाइलेशन के ओवरलैपिंग विश्लेषण । ए 268 वैश्विक प्रतिलेख, 119 माइटोकॉन्ड्रिया-संबद्ध प्रतिलेख, आरू डीएनए मिथाइल प्रतिलिपि के प्रतिनिधित्व करै छै जे सीरम आईपीए स्तर (वैश्विक प्रतिलेख आरू डीएनए मिथाइल के लेलऽ पी मान < 0.01, आरू माइटोकॉन्ड्रिया प्रतिलेख के लेलऽ पी मान < 0.05) स॑ जुड़लऽ 3092 सीपीजी साइट प॑ मैप करलऽ गेलऽ छै । प्रमुख ओवरलैपिंग ट्रांसक्रिप्ट बीच मे (AKT1 आ YKT6) देखाओल गेल अछि । B अन्य जीनऽ के साथ सबसें अधिक इंटरैक्शन स्कोर (0.900) वाला 13 जीनऽ के इंटरैक्शन मैप के निर्माण 56 ओवरलैपिंग जीन (ब्लैक लाइन क्षेत्र) स॑ करलऽ गेलऽ छेलै जे ऑनलाइन टूल स्ट्रिंगडीबी के उपयोग करी क॑ सीरम आईपीए स्तर स॑ महत्वपूर्ण रूप स॑ जुड़लऽ छेलै । ग्रीन: जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) कोशिकीय घटक: माइटोकॉन्ड्रिया (जीओ:0005739) के लिए मैप किया गया जीन | AKT1 डेटा (पाठ खनन, प्रयोग, डाटाबेस, आरू सह-अभिव्यक्ति के आधार प॑) के आधार प॑ अन्य प्रोटीनऽ के साथ बातचीत लेली सबसें अधिक स्कोर (0.900) वाला प्रोटीन छै । नेटवर्क नोड्स प्रोटीन के प्रतिनिधित्व करै छै, आरू किनारे प्रोटीन के बीच के कनेक्शन के प्रतिनिधित्व करै छै.
चूँकि आंत माइक्रोबायोटा मेटाबोलाइट्स डीएनए मिथाइलेशन [32] के माध्यम सं एपिजेनेटिक संरचना के नियंत्रित क सकैत अछि, हम जांच केलहुं जे सीरम आईपीए के स्तर लिवर डीएनए मिथाइलेशन सं जुड़ल अछि कि नहिं. हमनें पाया कि सीरम आईपीए स्तर स॑ जुड़लऽ दू प्रमुख मिथाइलेशन साइट प्रोलाइन-सेरीन-समृद्ध क्षेत्र 3 (C19orf55) आरू हीट शॉक प्रोटीन परिवार बी (छोटऽ) सदस्य 6 (HSPB6) (अतिरिक्त फाइल 3) के पास छेलै । 4350 CpG (p < 0.01) के डीएनए मिथाइलेशन सीरम आईपीए स्तर के साथ सहसंबंधित छेलै आरू दीर्घायु नियामक मार्ग (p = 0.006) (चित्र 1A, तालिका 2, आरू पूरक चित्र 1C) म॑ समृद्ध छेलै ।
सीरम आईपीए स्तर, वैश्विक प्रतिलेख, माइटोकॉन्ड्रिया-संबद्ध प्रतिलेख, आरू मानव यकृत म॑ डीएनए मिथाइलेशन के बीच संबंधऽ के अंतर्निहित जैविक तंत्र क॑ समझै लेली, हमन॑ पिछला मार्ग विश्लेषण म॑ पहचानलऽ गेलऽ जीनऽ के ओवरलैप विश्लेषण करलकै (चित्र 1 ए) । 56 ओवरलैपिंग जीन (चित्र 1A म॑ काली रेखा के अंदर) के मार्ग संवर्धन विश्लेषण के परिणाम स॑ पता चललै कि एपोप्टोसिस मार्ग (p = 0.00029) न॑ तीन विश्लेषणऽ लेली आम दू जीन क॑ उजागर करलकै: AKT1 आरू YKT6 (YKT6 v-SNARE होमोलॉग), जैसनऽ कि वेन आरेख (पूरक चित्र 2 आरू चित्र 1A) म॑ दिखालऽ गेलऽ छै । दिलचस्प बात ई छै कि हमनें पाया कि AKT1 (cg19831386) आरू YKT6 (cg24161647) के सीरम आईपीए स्तर (अतिरिक्त फाइल 3) के साथ सकारात्मक संबंध छेलै । जीन उत्पाद के बीच संभावित प्रोटीन अंतःक्रिया के पहचान करै लेली, हमन॑ 56 ओवरलैपिंग जीनऽ के बीच सबसें अधिक आम क्षेत्र स्कोर (0.900) वाला 13 जीन क॑ इनपुट के रूप म॑ चुनलकै आरू एक अंतःक्रिया नक्शा के निर्माण करलकै । विश्वास स्तर (सीमांत विश्वास) के अनुसार, सबसें अधिक स्कोर (0.900) वाला AKT1 जीन शीर्ष पर छेलै (चित्र 1B) ।
मार्ग विश्लेषण के आधार पर, हमनें पाया कि एपोप्टोसिस प्रमुख मार्ग छेलै, ई लेली हमनें जांच करलकै कि की आईपीए उपचार एचएससी के एपोप्टोसिस क॑ इन विट्रो म॑ प्रभावित करतै कि नै । हमनें पहलें ई प्रदर्शित करलकै कि आईपीए (10 μM, 100 μM, आरू 1 mM) केरऽ अलग-अलग खुराक LX-2 कोशिका लेली गैर-विषाक्त छेलै [15] । ई अध्ययन स॑ पता चललै कि 10 μM आरू 100 μM प॑ आईपीए उपचार स॑ व्यवहार्य आरू नेक्रोटिक कोशिका के संख्या म॑ वृद्धि होय छै । लेकिन, नियंत्रण समूह के साथ तुलना म॑ 1 एमएम आईपीए सांद्रता प॑ कोशिका व्यवहार्यता म॑ कमी ​​आबी गेलै, जबकि कोशिका परिगलन दर अपरिवर्तित रहलै (चित्र 2 ए, बी) । अगिला, LX-2 कोशिका म॑ एपोप्टोसिस क॑ प्रेरित करै लेली इष्टतम एकाग्रता खोजै लेली, हमन॑ 24 घंटा (चित्र 2 ए-ई आरू पूरक चित्र 3 ए-बी) के लेलऽ 10 μM, 100 μM, आरू 1 mM आईपीए के परीक्षण करलकै । दिलचस्प बात ई छै कि आईपीए 10 μM आरू 100 μM न॑ एपोप्टोसिस दर (%) म॑ कमी ​​करलकै, हालांकि, आईपीए 1 mM न॑ नियंत्रण के तुलना म॑ देर स॑ एपोप्टोसिस आरू एपोप्टोसिस दर (%) म॑ वृद्धि करलकै आरू अतः एकरा आगू के प्रयोग लेली चुनलऽ गेलै (चित्र 2A–D) ।
आईपीए एलएक्स-2 कोशिका के एपोप्टोसिस के प्रेरित करैत अछि | फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एपोप्टोटिक दर आरू कोशिका आकृति विज्ञान क॑ मात्राबद्ध करै लेली एनेक्सिन वी आरू 7-एएडी डबल धुंधलापन विधि के प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । बीए कोशिका क॑ 10 μM, 100 μM आरू 1 mM IPA स॑ 24 घंटा तलक या F–H TGF-β1 (5 ng/ml) आरू 1 mM IPA स॑ सीरम-मुक्त माध्यम म॑ 24 घंटा तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । एक: जीवित कोशिका (एनेक्सिन वी -/ 7AAD-); बी: नेक्रोटिक कोशिका (एनेक्सिन वी -/ 7AAD +); सी, एफ: जल्दी (एनेक्सिन वी +/ 7AAD-); डी, जी: देर से (एनेक्सिन वी + / 7एएडी। +); ई, एच: एपोप्टोटिक दर (%) में कुल प्रारंभिक एवं देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं का प्रतिशत | डेटा औसत ± एसडी, n = 3 स्वतंत्र प्रयोग के रूप में व्यक्त करलऽ गेलऽ छै । सांख्यिकीय तुलना बोनफेरोनी तदर्थ परीक्षण के साथ एकतरफा एनोवा के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै । * पी < 0.05; ****पी < 0.0001
जेना कि हम पहिने देखौने छी, 5 एनजी/एमएल TGF-β1 शास्त्रीय मार्कर जीन के अभिव्यक्ति बढ़ा क HSC सक्रियण के प्रेरित क सकैत अछि [15] । LX-2 कोशिकाओं क॑ संयोजन म॑ 5 एनजी/एमएल TGF-β1 आरू 1 एमएम आईपीए स॑ उपचारित करलऽ गेलऽ छेलै (चित्र 2E-H) । TGF-β1 उपचार न॑ एपोप्टोसिस दर म॑ बदलाव नै करलकै, हालांकि, आईपीए सह-उपचार न॑ TGF-β1 उपचार (चित्र 2E-H) के तुलना म॑ देर स॑ एपोप्टोसिस आरू एपोप्टोसिस दर (%) म॑ वृद्धि करलकै । ई परिणाम संकेत करै छै कि 1 एमएम आईपीए TGF-β1 प्रेरण स॑ स्वतंत्र रूप स॑ LX-2 कोशिका म॑ एपोप्टोसिस क॑ बढ़ावा द॑ सकै छै ।
हमनें एलएक्स-2 कोशिका म॑ माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन प॑ आईपीए केरऽ प्रभाव के आरू जांच करलकै । परिणाम स॑ पता चललै कि 1 एमएम आईपीए न॑ ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) पैरामीटर म॑ कमी ​​करलकै: गैर-माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन, बेसल आरू अधिकतम श्वसन, प्रोटॉन लीक आरू एटीपी उत्पादन नियंत्रण समूह (चित्र 3 ए, बी) के तुलना म॑, जबकि जैव ऊर्जावान स्वास्थ्य सूचकांक (बीएचआई) म॑ कोनो बदलाव नै ऐलै ।
आईपीए एलएक्स-2 कोशिका मे माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन कें कम करएयत छै. माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन वक्र (OCR) क॑ माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन पैरामीटर (गैर-माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन, बेसल श्वसन, अधिकतम श्वसन, प्रोटॉन लीक, एटीपी जनरेशन, एसआरसी आरू बीएचआई) के रूप म॑ प्रस्तुत करलऽ गेलऽ छै । कोशिका ए आरू बी क॑ क्रमशः 10 μM, 100 μM आरू 1 mM IPA स॑ क्रमशः 24 घंटा तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । कोशिका सी आरू डी क॑ क्रमशः 24 घंटा तलक सीरम-मुक्त माध्यम म॑ TGF-β1 (5 एनजी/एमएल) आरू 1 एमएम आईपीए के साथ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । सब मापन क॑ CyQuant किट के उपयोग करी क॑ डीएनए सामग्री प॑ सामान्य करलऽ गेलऽ छेलै । बीएचआई: जैव ऊर्जावान स्वास्थ्य सूचकांक; एसआरसी: श्वसन रिजर्व क्षमता; ओसीआर: ऑक्सीजन खपत दर। डेटा औसत ± मानक विचलन (एसडी), n = 5 स्वतंत्र प्रयोग के रूप मे प्रस्तुत करल गेल छै. एकतरफा एनोवा आरू बोनफेरोनी तदर्थ परीक्षण के उपयोग स॑ सांख्यिकीय तुलना करलऽ गेलऽ छेलै । * पी < 0.05; ** पी <0.01; आ *** पी < 0.001
TGF-β1-सक्रिय LX-2 कोशिकाओं के जैव ऊर्जावान प्रोफाइल पर आईपीए के प्रभाव की अधिक व्यापक समझ प्राप्त करने के लिए, हमने ओसीआर (चित्र 3 सी, डी) द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन का विश्लेषण किया। परिणाम स॑ पता चललै कि TGF-β1 उपचार नियंत्रण समूह (चित्र 3C,D) के तुलना म॑ अधिकतम श्वसन, श्वसन रिजर्व क्षमता (SRC) आरू BHI क॑ कम करी सकै छै । एकरऽ अलावा, संयोजन उपचार स॑ बेसल श्वसन, प्रोटॉन लीक आरू एटीपी उत्पादन म॑ कमी ​​आबी गेलै, लेकिन एसआरसी आरू बीएचआई टीजीएफ-बीटा१ स॑ उपचारित लोगऽ स॑ काफी अधिक छेलै (चित्र 3 सी,डी) ।
हमनें सीहॉर्स सॉफ्टवेयर (पूरक चित्र 4A–D) द्वारा उपलब्ध कराय देलऽ गेलऽ “कोशिकीय ऊर्जा फेनोटाइप परीक्षण” भी करलकै । जैना कि पूरक चित्र 3 बी म॑ दिखालऽ गेलऽ छै, TGF-β1 उपचार के बाद ओसीआर आरू ईसीएआर दूनू चयापचय क्षमता म॑ कमी ​​आबी गेलऽ छेलै, हालांकि, नियंत्रण समूह के तुलना म॑ संयोजन आरू आईपीए उपचार समूह म॑ कोनों अंतर नै देखलऽ गेलऽ छेलै । एकरऽ अलावा, नियंत्रण समूह (पूरक चित्र 4 सी) के तुलना म॑ संयोजन आरू आईपीए उपचार के बाद ओसीआर केरऽ बेसल आरू तनाव दूनू स्तर म॑ कमी ​​आबी गेलऽ छेलै । दिलचस्प बात ई छै कि संयोजन चिकित्सा के साथ भी एक समान पैटर्न देखलऽ गेलऽ छेलै, जहां TGF-β1 उपचार (पूरक चित्र 4C) के तुलना म॑ ईसीएआर केरऽ बेसल आरू तनाव स्तर म॑ कोनो बदलाव नै देखलऽ गेलऽ छेलै । एचएससी म॑ माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन म॑ कमी ​​आरू टीजीएफ-बीटा१ उपचार के संपर्क म॑ ऐला के बाद एससीआर आरू बीएचआई क॑ बहाल करै के संयोजन उपचार के क्षमता न॑ चयापचय क्षमता (ओसीआर आरू ईसीएआर) म॑ कोनो बदलाव नै करलकै । एक साथ लेलऽ जाय त॑ ई परिणाम संकेत करै छै कि आईपीए एचएससी म॑ जैव ऊर्जा विज्ञान क॑ कम करी सकै छै, जेकरा स॑ पता चलै छै कि आईपीए कम ऊर्जावान प्रोफाइल क॑ प्रेरित करी सकै छै जे एचएससी फेनोटाइप क॑ निष्क्रियता के तरफ शिफ्ट करी दै छै (पूरक चित्र 4D) ।
माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता पर आईपीए के प्रभाव के जांच माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान आरू नेटवर्क कनेक्शन के तीन आयामी मात्रा निर्धारण के साथ-साथ एमटीआर धुंधलापन (चित्र 4 आरू पूरक चित्र 5) के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै । चित्र 4 स॑ पता चलै छै कि, नियंत्रण समूह के साथ तुलना म॑, TGF-β1 उपचार न॑ औसत सतह क्षेत्रफल, शाखा संख्या, कुल शाखा लंबाई, आरू शाखा जंक्शन संख्या (चित्र 4A आरू B) म॑ कमी ​​करलकै आरू माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ अनुपात म॑ गोलाकार स॑ मध्यवर्ती आकृति विज्ञान म॑ बदलाव करलकै (चित्र 4C) । केवल आईपीए उपचार स॑ औसत माइटोकॉन्ड्रिया आयतन म॑ कमी ​​आबी गेलै आरू नियंत्रण समूह के तुलना म॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ अनुपात गोलाकार स॑ मध्यवर्ती आकृति विज्ञान म॑ बदली गेलै (चित्र ४ ए) । एकरऽ विपरीत, माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली संभावना-निर्भर एमटीआर (चित्र 4 ए आरू ई) द्वारा आकलन करलऽ गेलऽ गोलाकारता, औसत शाखा लंबाई, आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि अपरिवर्तित रहलै आरू ई पैरामीटर समूहऽ के बीच अंतर नै छेलै । एक साथ लेलऽ जाय त॑ ई परिणाम स॑ पता चलै छै कि TGF-β1 आरू IPA उपचार जीवित LX-2 कोशिका म॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ आकार आरू आकार के साथ-साथ नेटवर्क जटिलता क॑ संतुलित करै वाला प्रतीत होय छै ।
आईपीए एलएक्स-2 कोशिका म॑ माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता आरू माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए प्रचुरता म॑ बदलाव करै छै । ए सीरम-मुक्त माध्यम म॑ TGF-β1 (5 एनजी/एमएल) आरू 1 एमएम आईपीए स॑ 24 घंटा तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ जीवित LX-2 कोशिका केरऽ प्रतिनिधि कॉनफोकल छवि जेकरा म॑ माइटोट्रैकर TM रेड CMXRos स॑ रंगलऽ माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क आरू DAPI स॑ नीले रंग के नाभिक दिखालऽ गेलऽ छै । सब डाटा मे प्रति समूह कम स कम 15 छवि छल। हम प्रत्येक नमूना प्रकार के लेल 10 जेड-स्टैक छवि प्राप्त केलहुं। प्रत्येक जेड-अक्ष अनुक्रम म॑ ३० स्लाइस छेलै, जेकरऽ हर एक के मोटाई ९.८६ माइक्रोन छेलै । पैमाने पर पट्टी: 10 माइक्रोन। B. छवि पर अनुकूली थ्रेशोल्डिंग लागू कए चिन्हित प्रतिनिधि वस्तु (केवल माइटोकॉन्ड्रिया) । प्रत्येक समूह केरऽ सब कोशिका के लेलऽ मात्रात्मक विश्लेषण आरू माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान नेटवर्क कनेक्शन के तुलना करलऽ गेलऽ छेलै । ग. माइटोकॉन्ड्रिया आकार अनुपात की आवृत्ति। 0 के करीब के मान गोलाकार आकृति के दर्शाबै छै, आरू 1 के करीब के मान फिलामेंटस आकृति के दर्शाबै छै. D माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए (mtDNA) सामग्री सामग्री आरू विधि म॑ वर्णित के अनुसार निर्धारित करलऽ गेलऽ छेलै । ई माइटोट्रैकर TM रेड सीएमएक्सआरओएस विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री (30,000 घटना) द्वारा करल गेलय छेलै जैना कि सामग्री आरू विधियऽ म॑ वर्णित छै । डेटा औसत ± एसडी, n = 3 स्वतंत्र प्रयोग के रूप मे प्रस्तुत कयल गेल अछि | एकतरफा एनोवा आरू बोनफेरोनी तदर्थ परीक्षण के उपयोग स॑ सांख्यिकीय तुलना करलऽ गेलऽ छेलै । * पी < 0.05; ** पी <0.01; *** पी < 0.001; ****पी < 0.0001
तखन हम माइटोकॉन्ड्रिया संख्या के सूचक के रूप में LX-2 कोशिका में mtDNA सामग्री के विश्लेषण केलहुं। नियंत्रण समूह के साथ तुलना म॑ TGF-β1-उपचारित समूह म॑ mtDNA सामग्री बढ़ी गेलऽ छेलै (चित्र 4D) । TGF-β1-उपचारित समूह के साथ तुलना म॑ संयोजन उपचार समूह (चित्र 4D) म॑ mtDNA सामग्री म॑ कमी ​​आबी गेलऽ छेलै, जेकरा स॑ पता चलै छै कि आईपीए mtDNA सामग्री आरू संभवतः माइटोकॉन्ड्रिया संख्या के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन (चित्र 3C) क॑ भी कम करी सकै छै । एतबे नै, आईपीए न॑ संयोजन उपचार म॑ mtDNA सामग्री क॑ कम करलकै लेकिन एमटीआर-मध्यस्थता वाला माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि क॑ प्रभावित नै करलकै (चित्र 4A-C) ।
हमनें एलएक्स-2 कोशिकाओं (चित्र 5 ए-डी) म॑ फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस, जीवित रहना, आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता स॑ जुड़लऽ जीन केरऽ mRNA स्तर के साथ आईपीए केरऽ संबंध के जांच करलकै । नियंत्रण समूह के तुलना म॑ TGF-β1-उपचारित समूह न॑ कोलेजन टाइप I α2 चेन (COL1A2), α-स्मूद मसल एक्टिन (αSMA), मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज 2 (MMP2), मेटालोप्रोटीनेज 1 (TIMP1), आरू डायनामिन 1 जैसनऽ जीन (DRP1) के ऊतक अवरोधक जैसनऽ जीन के अभिव्यक्ति म॑ वृद्धि देखैलकै फाइब्रोसिस एवं सक्रियण। एकरऽ अलावा, नियंत्रण समूह के साथ तुलना म॑ TGF-β1 उपचार न॑ न्यूक्लियर प्रेग्नेन एक्स रिसेप्टर (PXR), कैस्पेस 8 (CASP8), MAPKAPK3, बी-सेल α केरऽ अवरोधक, न्यूक्लियर फैक्टर κ जीन लाइट पेप्टाइड (NFκB1A) केरऽ एन्हांसर, आरू न्यूक्लियर फैक्टर κB किनेज़ सबयूनिट β (IKBKB) केरऽ अवरोधक केरऽ mRNA स्तर म॑ कमी ​​करलकै (चित्र 5A–D) । TGF-β1 उपचार के तुलना म॑ TGF-β1 आरू IPA के साथ संयोजन उपचार न॑ COL1A2 आरू MMP2 के अभिव्यक्ति म॑ कमी ​​करलकै, लेकिन PXR, TIMP1, बी-सेल लिम्फोमा-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, आरू IKBKB केरऽ mRNA स्तर म॑ वृद्धि करलकै । आईपीए उपचार न॑ एमएमपी२, बीसीएल-२-संबद्ध प्रोटीन एक्स (बीएएक्स), एकेटी१, ऑप्टिक एट्रोफी प्रोटीन १ (ओपीए१), आरू माइटोकॉन्ड्रिया फ्यूजन प्रोटीन २ (एमएफएन२) के अभिव्यक्ति म॑ काफी कमी करलकै, जबकि नियंत्रण समूह के तुलना म॑ सीएएसपी८, एनएफएकबी१ए, एनएफएकबी१बी, आरू आईकेबीकेबी केरऽ अभिव्यक्ति म॑ वृद्धि होय गेलै । लेकिन, कैस्पेस-3 (CASP3), एपोप्टोटिक पेप्टाइडेज एक्टिवेटिंग फैक्टर 1 (APAF1), माइटोकॉन्ड्रिया फ्यूजन प्रोटीन 1 (MFN1), आरू फिशन प्रोटीन 1 (FIS1) के अभिव्यक्ति म॑ कोनो अंतर नै मिललै । सामूहिक रूप स॑ ई परिणाम स॑ पता चलै छै कि आईपीए उपचार फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस, जीवित रहना, आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता स॑ जुड़लऽ जीन के अभिव्यक्ति क॑ संतुलित करै छै । हमरऽ डाटा स॑ पता चलै छै कि आईपीए उपचार स॑ एलएक्स-2 कोशिका म॑ फाइब्रोसिस कम होय जाय छै; एकरऽ साथ ही ई फेनोटाइप क॑ निष्क्रियता के तरफ शिफ्ट करी क॑ जीवित रहना क॑ उत्तेजित करै छै ।
आईपीए एलएक्स-2 कोशिका म॑ फाइब्रोब्लास्ट, एपोप्टोटिक, व्यवहार्यता, आरू माइटोकॉन्ड्रिया डायनामिक्स जीन केरऽ अभिव्यक्ति क॑ संतुलित करै छै । हिस्टोग्राम LX-2 कोशिका क॑ 24 घंटा तलक सीरम-मुक्त माध्यम म॑ TGF-β1 आरू IPA स॑ प्रेरित करला के बाद अंतर्जात नियंत्रण (RPLP0 या PPIA) के सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति प्रदर्शित करै छै । ए फाइब्रोब्लास्ट, बी एपोप्टोटिक कोशिका, सी जीवित कोशिका, आरू डी माइटोकॉन्ड्रिया डायनामिक्स जीन अभिव्यक्ति क॑ दर्शाबै छै । डेटा औसत ± मानक विचलन (एसडी), n = 3 स्वतंत्र प्रयोग के रूप मे प्रस्तुत करल गेल छै. एकतरफा एनोवा आरू बोनफेरोनी तदर्थ परीक्षण के उपयोग स॑ सांख्यिकीय तुलना करलऽ गेलऽ छेलै । * पी < 0.05; ** पी <0.01; *** पी < 0.001; ****पी < 0.0001
तखन, कोशिका आकार (FSC-H) आरू कोशिका द्रव्य जटिलता (SSC-H) म॑ परिवर्तन के आकलन फ्लो साइटोमेट्री (चित्र 6A,B) द्वारा करलऽ गेलऽ छेलै, आरू आईपीए उपचार के बाद कोशिका आकृति विज्ञान म॑ बदलाव के आकलन संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) आरू चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (पूरक चित्र 6A-B) द्वारा करलऽ गेलऽ छेलै । अपेक्षित रूप स॑, TGF-β1-उपचारित समूह म॑ कोशिका न॑ नियंत्रण समूह (चित्र 6A,B) के तुलना म॑ आकार म॑ वृद्धि करलकै, जेकरा स॑ रफ एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर *) आरू फेगोलाइसोसोम (पी) केरऽ क्लासिक विस्तार दिखालऽ गेलऽ छै, जे हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) सक्रियण (पूरक चित्र 6 ए) क॑ दर्शाबै छै । लेकिन, TGF-β1-उपचारित समूह के साथ तुलना म॑, कोशिका आकार, कोशिका द्रव्य जटिलता (चित्र 6 ए, बी), आरू ईआर * सामग्री म॑ TGF-β1 आरू आईपीए संयोजन उपचार समूह (पूरक चित्र 6 ए) म॑ कमी ​​आबी गेलऽ छेलै । एकरऽ अलावा, आईपीए उपचार न॑ नियंत्रण समूह के तुलना म॑ कोशिका आकार, कोशिका द्रव्य जटिलता (चित्र 6 ए, बी), पी आरू ईआर * सामग्री (पूरक चित्र 6 ए) म॑ कमी ​​करलकै । एकरऽ अलावा, नियंत्रण समूह (सफेद तीर, पूरक चित्र 6 बी) के तुलना म॑ आईपीए उपचार के 24 घंटा के बाद एपोप्टोटिक कोशिका के सामग्री म॑ वृद्धि होय गेलै । सामूहिक रूप स॑, ई परिणाम बताबै छै कि 1 एमएम आईपीए एचएससी एपोप्टोसिस क॑ उत्तेजित करी सकै छै आरू TGF-β1 द्वारा प्रेरित कोशिका आकृति विज्ञान पैरामीटर म॑ बदलाव क॑ उलट॑ सकै छै, जेकरा स॑ कोशिका केरऽ आकार आरू जटिलता क॑ नियंत्रित करलऽ जाय सकै छै, जे एचएससी निष्क्रियता स॑ जुड़लऽ होय सकै छै ।
आईपीए एलएक्स-2 कोशिका म॑ कोशिका के आकार आरू कोशिका द्रव्य जटिलता म॑ बदलाव करै छै । प्रवाह कोशिकामिति विश्लेषण के प्रतिनिधि छवियाँ। विश्लेषण म॑ एलएक्स-2 कोशिका लेली विशिष्ट गेटिंग रणनीति के प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै: कोशिका आबादी क॑ परिभाषित करै लेली एसएससी-ए/एफएससी-ए, डबलट के पहचान करै लेली एफएससी-एच/एफएससी-ए, आरू कोशिका आकार आरू जटिलता विश्लेषण लेली एसएससी-एच/एफएससी-एच । कोशिका क॑ सीरम-मुक्त माध्यम म॑ TGF-β1 (5 एनजी/एमएल) आरू 1 एमएम आईपीए स॑ 24 घंटा तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । LX-2 कोशिका क॑ कोशिका आकार आरू कोशिका द्रव्य जटिलता विश्लेषण लेली निचला बायां क्वाड्रंट (SSC-H-/FSC-H-), ऊपरी बायां क्वाड्रंट (SSC-H+/FSC-H-), निचला दाहिना क्वाड्रंट (SSC-H-/FSC-H+), आरू ऊपरी दाहिना क्वाड्रंट (SSC-H+/FSC-H+) म॑ वितरित करलऽ गेलऽ छेलै । बी.कोशिका आकृति विज्ञान क॑ एफएससी-एच (अग्र बिखरऽ, कोशिका आकार) आरू एसएससी-एच (साइड बिखरऽ, कोशिका द्रव्य जटिलता) (30,000 घटना) के उपयोग करी क॑ फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै । डेटा औसत ± एसडी, n = 3 स्वतंत्र प्रयोग के रूप मे प्रस्तुत कयल गेल अछि | एकतरफा एनोवा आरू बोनफेरोनी तदर्थ परीक्षण के उपयोग स॑ सांख्यिकीय तुलना करलऽ गेलऽ छेलै । * पी < 0.05; ** पी <0.01; ***पी < 0.001 आ ****पी < 0.0001
आईपीए जैसनऽ आंतऽ के मेटाबोलाइट्स शोध केरऽ एगो गरम विषय बनी गेलऽ छै, जेकरा स॑ पता चलै छै कि आंतऽ के माइक्रोबायोटा म॑ नया लक्ष्य के खोज होय सकै छै । अतः ई दिलचस्प छै कि आईपीए, एक मेटाबोलाइट जेकरा हम्मं॑ मनुष्य म॑ लिवर फाइब्रोसिस स॑ जोड़न॑ छियै [15], जानवरऽ के मॉडल म॑ संभावित एंटी-फाइब्रोटिक यौगिक के रूप म॑ देखलऽ गेलऽ छै [13, 14] । यहाँ, हम पहिलऽ बार टाइप 2 डायबिटीज (T2D) के बिना मोटापा वाला व्यक्तियऽ म॑ सीरम आईपीए आरू ग्लोबल लिवर ट्रांसक्रिप्टोमिक्स आरू डीएनए मिथाइलेशन के बीच एगो संबंध के प्रदर्शन करै छियै, जेकरा म॑ एपोप्टोसिस, माइटोफेजी आरू दीर्घायु के साथ-साथ लिवर होमियोस्टेसिस क॑ नियंत्रित करै वाला एगो संभावित उम्मीदवार जीन AKT1 क॑ भी उजागर करलऽ गेलऽ छै । हमरऽ अध्ययन केरऽ एगो आरू नवीनता ई छै कि हमन॑ एलएक्स-2 कोशिका म॑ एपोप्टोसिस, कोशिका आकृति विज्ञान, माइटोकॉन्ड्रिया जैव ऊर्जा विज्ञान आरू गतिशीलता के साथ आईपीए उपचार केरऽ अंतःक्रिया के प्रदर्शन करलकै, जे एक कम ऊर्जा स्पेक्ट्रम के संकेत दै छै जे एचएससी फेनोटाइप क॑ निष्क्रियता के तरफ शिफ्ट करै छै, जेकरा स॑ आईपीए लिवर फाइब्रोसिस म॑ सुधार लेली एगो संभावित उम्मीदवार बनी जाय छै ।
हमनें पाया कि एपोप्टोसिस, माइटोफेजी आरू दीर्घायु परिसंचारी सीरम आईपीए स॑ जुड़लऽ लिवर जीन स॑ समृद्ध सबसें महत्वपूर्ण कैनोनिकल मार्ग छेलै । माइटोकॉन्ड्रिया गुणवत्ता नियंत्रण (MQC) प्रणाली केरऽ विघटन स॑ माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विकार, माइटोफेजी आरू एपोप्टोसिस होय सकै छै, जेकरा स॑ MASLD केरऽ घटना क॑ बढ़ावा मिल॑ सकै छै [33, 34] । अतः हम अनुमान लगा सकै छियै कि आईपीए एपोप्टोसिस, माइटोफेजी आरू यकृत म॑ दीर्घायु के माध्यम स॑ कोशिका गतिशीलता आरू माइटोकॉन्ड्रिया अखंडता क॑ बनाए रखै म॑ शामिल होय सकै छै । हमरऽ आंकड़ा स॑ पता चललै कि तीनों परख म॑ दू जीन आम छेलै: वाईकेटी६ आरू एकेटी१ । ध्यान देबऽ के बात छै कि YKT6 एगो SNARE प्रोटीन छै जे कोशिका झिल्ली संलयन के प्रक्रिया म॑ शामिल छै । ई ऑटोफेगोसोम प॑ STX17 आरू SNAP29 के साथ एक आरंभ परिसर बनाबै क॑ ऑटोफेजी आरू माइटोफेजी म॑ भूमिका निभाबै छै, जेकरा स॑ ऑटोफेगोसोम आरू लाइसोसोम केरऽ संलयन क॑ बढ़ावा मिलै छै [35] । एकरऽ अलावा, YKT6 केरऽ कार्य केरऽ नुकसान के परिणामस्वरूप माइटोफेजी बिगड़ै छै [36], जबकि YKT6 केरऽ अपरेग्यूलेशन हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (HCC) केरऽ प्रगति स॑ जुड़लऽ छै, जे कोशिका केरऽ जीवित रहना म॑ वृद्धि दिखाबै छै [37] । दोसरऽ तरफ, AKT1 सबसें महत्वपूर्ण इंटरैक्टिंग जीन छै आरू यकृत रोगऽ म॑ महत्वपूर्ण भूमिका निभाबै छै, जेकरा म॑ PI3K/AKT संकेत मार्ग, कोशिका चक्र, कोशिका प्रवासन, प्रसार, फोकल आसंजन, माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ कार्य, आरू कोलेजन स्राव शामिल छै [38-40] । सक्रिय PI3K/AKT संकेत मार्ग हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल (HSCs) क॑ सक्रिय करी सकै छै, जे बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ECM) केरऽ उत्पादन लेली जिम्मेदार कोशिका छै, आरू एकरऽ विनियमन लिवर फाइब्रोसिस केरऽ घटना आरू प्रगति म॑ योगदान द॑ सकै छै [40] । एकरऽ अलावा, एकेटी प्रमुख कोशिका जीवित रहय के कारकऽ म॑ स॑ एक छै जे p53-निर्भर कोशिका एपोप्टोसिस क॑ रोक॑ छै, आरू एकेटी सक्रियण लिवर कोशिका एपोप्टोसिस केरऽ निरोध स॑ जुड़लऽ होय सकै छै [41, 42] । प्राप्त परिणाम स॑ पता चलै छै कि आईपीए एपोप्टोसिस म॑ प्रवेश या जीवित रहना के बीच हेपेटोसाइट्स केरऽ निर्णय क॑ प्रभावित करी क॑ लिवर माइटोकॉन्ड्रिया स॑ जुड़लऽ एपोप्टोसिस म॑ शामिल होय सकै छै । ई प्रभाव एकेटी आ/अथवा वाईकेटी6 कैंडिडेट जीन द्वारा नियंत्रित भ सकैत अछि, जे लिवर होमियोस्टेसिस के लेल महत्वपूर्ण अछि ।
हमरऽ परिणाम स॑ पता चललै कि 1 एमएम आईपीए न॑ TGF-β1 उपचार स॑ स्वतंत्र LX-2 कोशिका म॑ एपोप्टोसिस क॑ प्रेरित करलकै आरू माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन म॑ कमी ​​करलकै । उल्लेखनीय छै कि एपोप्टोसिस फाइब्रोसिस रिजोल्यूशन आरू हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियण केरऽ एगो प्रमुख मार्ग छै, आरू लिवर फाइब्रोसिस केरऽ रिवर्सिबल शारीरिक प्रतिक्रिया म॑ भी एगो प्रमुख घटना छै [4, 43] । एतबे नै, संयोजन उपचार के बाद एलएक्स-2 कोशिका मँ बीएचआई के बहाली स॑ माइटोकॉन्ड्रिया जैव ऊर्जा विज्ञान के नियमन म॑ आईपीए के संभावित भूमिका के बारे म॑ नया जानकारी मिललै । आराम आरू निष्क्रिय परिस्थिति म॑ हेमेटोपोइएटिक कोशिका सामान्य रूप स॑ एटीपी पैदा करै लेली माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन के उपयोग करै छै आरू एकरऽ चयापचय गतिविधि कम होय छै । दोसरऽ तरफ, एचएससी सक्रियण ग्लाइकोलाइटिक अवस्था म॑ प्रवेश करै के ऊर्जा के मांग के भरपाई करै लेली माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन आरू जैव संश्लेषण क॑ बढ़ाबै छै [44] । ई तथ्य कि आईपीए न॑ मेटाबोलिक क्षमता आरू ईसीएआर क॑ प्रभावित नै करलकै, ई स॑ पता चलै छै कि ग्लाइकोलाइटिक मार्ग क॑ कम प्राथमिकता देलऽ गेलऽ छै । तहिना, एकटा आरू अध्ययन स॑ पता चललै कि 1 एमएम आईपीए कार्डियोमायोसाइट्स, मानव हेपेटोसाइट सेल लाइन (Huh7) आरू मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिका (HUVEC) म॑ माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन श्रृंखला गतिविधि क॑ संतुलित करै म॑ सक्षम छेलै; लेकिन, कार्डियोमायोसाइट्स में ग्लाइकोलाइसिस पर आईपीए केरऽ कोय प्रभाव नै मिललै, जेकरा स॑ पता चलै छै कि आईपीए अन्य कोशिका प्रकार केरऽ जैव ऊर्जा विज्ञान क॑ प्रभावित करी सकै छै [45] । अतः, हम अनुमान लगाबै छियै कि 1 एमएम आईपीए एक हल्का रासायनिक अनकपलर के रूप म॑ काम करी सकै छै, कैन्हेंकि ई mtDNA केरऽ मात्रा म॑ बदलाव के बिना फाइब्रोजेनिक जीन अभिव्यक्ति, कोशिका आकृति विज्ञान आरू माइटोकॉन्ड्रिया जैव ऊर्जा विज्ञान क॑ काफी कम करी सकै छै [46] । माइटोकॉन्ड्रिया अनकपलर संस्कृति-प्रेरित फाइब्रोसिस आरू एचएससी सक्रियण [47] क॑ रोक॑ सकै छै आरू कुछ प्रोटीन जैना कि अनकपलिंग प्रोटीन (UCP) या एडेनिन न्यूक्लियोटाइड ट्रांसलोकेज (ANT) द्वारा नियंत्रित या प्रेरित माइटोकॉन्ड्रिया एटीपी उत्पादन क॑ कम करी सकै छै । कोशिका प्रकार के आधार पर, ई घटना कोशिका के एपोप्टोसिस सं बचा सकैत अछि आ/अथवा एपोप्टोसिस के बढ़ावा द सकैत अछि [46] । लेकिन, हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल निष्क्रियता म॑ माइटोकॉन्ड्रिया अनकपलर के रूप म॑ आईपीए के भूमिका क॑ स्पष्ट करै लेली आरू अध्ययन के जरूरत छै ।
तखन हम ई जांच केलहुं जे माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन मे परिवर्तन जीवित एलएक्स-2 कोशिका मे माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान मे परिलक्षित होइत अछि कि नहि । दिलचस्प बात ई छै कि TGF-β1 उपचार माइटोकॉन्ड्रिया अनुपात म॑ गोलाकार स॑ मध्यवर्ती म॑ बदलाव करै छै, जेकरा म॑ माइटोकॉन्ड्रिया शाखा म॑ कमी ​​आरू DRP1 केरऽ अभिव्यक्ति म॑ वृद्धि होय छै, जे माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन म॑ एगो प्रमुख कारक छै [48] । एकरऽ अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ विखंडन समग्र नेटवर्क जटिलता स॑ जुड़लऽ छै, आरू संलयन स॑ विखंडन म॑ संक्रमण हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियण लेली महत्वपूर्ण छै, जबकि माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन केरऽ निरोध स॑ एचएससी एपोप्टोसिस होय जाय छै [49] । इस प्रकार, हमरऽ परिणाम संकेत करै छै कि TGF-β1 उपचार शाखाबंदी म॑ कमी ​​के साथ माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क जटिलता म॑ कमी ​​क॑ प्रेरित करी सकै छै, जे सक्रिय हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल (HSCs) स॑ जुड़लऽ माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन म॑ अधिक आम छै । एकरऽ अलावा, हमरऽ आंकड़ा स॑ पता चललै कि आईपीए माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ अनुपात क॑ गोलाकार स॑ मध्यवर्ती आकार म॑ बदली सकै छै, जेकरा स॑ ओपीए१ आरू एमएफएन२ केरऽ अभिव्यक्ति म॑ कमी ​​आबी सकै छै । अध्ययन स॑ पता चललै छै कि OPA1 केरऽ डाउनरेगुलेशन स॑ माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली केरऽ क्षमता म॑ कमी ​​आबी सकै छै आरू कोशिका एपोप्टोसिस क॑ ट्रिगर करी सकै छै [50] । MFN2 माइटोकॉन्ड्रिया संलयन आ एपोप्टोसिस के मध्यस्थता के लेल जानल जाइत अछि [51] । प्राप्त परिणाम स॑ पता चलै छै कि TGF-β1 आरू/या IPA द्वारा LX-2 कोशिका केरऽ प्रेरण माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ आकार आरू आकार के साथ-साथ सक्रियण अवस्था आरू नेटवर्क जटिलता क॑ संतुलित करै वाला प्रतीत होय छै ।
हमरऽ परिणाम संकेत करै छै कि TGFβ-1 आरू IPA केरऽ संयोजन उपचार एपोप्टोसिस-चकमाबै वाला कोशिका म॑ फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस आरू जीवित रहना स॑ संबंधित जीन केरऽ mRNA अभिव्यक्ति क॑ नियंत्रित करी क॑ mtDNA आरू कोशिका आकृति विज्ञान पैरामीटर क॑ कम करी सकै छै । दरअसल, आईपीए न॑ AKT1 आरू महत्वपूर्ण फाइब्रोसिस जीन जेना कि COL1A2 आरू MMP2 केरऽ mRNA अभिव्यक्ति स्तर म॑ कमी ​​करलकै, लेकिन CASP8 केरऽ अभिव्यक्ति स्तर म॑ वृद्धि करलकै, जे एपोप्टोसिस स॑ जुड़लऽ छै । हमरऽ परिणाम स॑ पता चललै कि आईपीए उपचार के बाद, BAX अभिव्यक्ति म॑ कमी ​​आबी गेलै आरू TIMP1 परिवार केरऽ सबयूनिट, बीसीएल-2 आरू NF-κB केरऽ mRNA अभिव्यक्ति बढ़ी गेलै, जेकरा स॑ पता चलै छै कि आईपीए हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल (HSCs) म॑ जीवित रहै के संकेत क॑ उत्तेजित करी सकै छै जे एपोप्टोसिस स॑ बचै छै । ई अणु सक्रिय हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल म॑ प्रो-सर्वाइवल सिग्नल के रूप म॑ काम करी सकै छै, जे एंटी-एपोप्टोटिक प्रोटीन (जैना कि Bcl-2) केरऽ अभिव्यक्ति म॑ वृद्धि, प्रो-एपोप्टोटिक BAX केरऽ अभिव्यक्ति म॑ कमी, आरू TIMP आरू NF-κB के बीच जटिल अंतःक्रिया स॑ जुड़लऽ होय सकै छै [5, 7] । आईपीए पीएक्सआर के माध्यम स॑ अपनऽ प्रभाव डालै छै, आरू हमन॑ पालै छै कि TGF-β1 आरू आईपीए के साथ संयोजन उपचार न॑ पीएक्सआर mRNA अभिव्यक्ति के स्तर म॑ वृद्धि करलकै, जे एचएससी सक्रियण के दमन के संकेत दै छै । सक्रिय पीएक्सआर संकेत एचएससी सक्रियण क॑ इन विवो आरू इन विट्रो दूनू म॑ रोकै लेली जानलऽ जाय छै [52, 53] । हमरऽ परिणाम संकेत करै छै कि आईपीए एपोप्टोसिस क॑ बढ़ावा द॑ क॑ सक्रिय एचएससी केरऽ निकासी म॑ भाग ल॑ सकै छै, फाइब्रोसिस आरू माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय क॑ कम करी क॑, आरू जीवित रहना के संकेत बढ़ाबै छै, जे विशिष्ट प्रक्रिया छै जे सक्रिय एचएससी फेनोटाइप क॑ निष्क्रिय म॑ बदलै छै । एपोप्टोसिस म॑ आईपीए केरऽ संभावित तंत्र आरू भूमिका केरऽ एगो आरू संभावित व्याख्या ई छै कि ई मुख्य रूप स॑ माइटोफेजी (आंतरिक मार्ग) आरू बाह्य टीएनएफ संकेत मार्ग (तालिका १) के माध्यम स॑ बेकाम माइटोकॉन्ड्रिया क॑ स्केवेंज करै छै, जे सीधे एनएफ-केबी जीवित रहना संकेत मार्ग स॑ जुड़लऽ छै (पूरक चित्र 7) । दिलचस्प बात ई छै कि आईपीए स॑ संबंधित समृद्ध जीन एपोप्टोटिक मार्ग म॑ प्रो-एपोप्टोटिक आरू प्रो-सर्वाइवल सिग्नल क॑ प्रेरित करै म॑ सक्षम छै [54] , जेकरा स॑ पता चलै छै कि आईपीए ई जीनऽ स॑ बातचीत करी क॑ एपोप्टोटिक मार्ग या जीवित रहना क॑ प्रेरित करी सकै छै । लेकिन, एचएससी सक्रियण के दौरान आईपीए एपोप्टोसिस या जीवित रहना केना प्रेरित करै छै आरू एकरऽ यंत्रवत् मार्ग ई स्पष्ट नै छै ।
आईपीए एकटा माइक्रोबियल मेटाबोलाइट छै जे आंत कें माइक्रोबायोटा कें माध्यम सं आहार मे ट्रिप्टोफैन सं बनल छै. अध्ययनऽ स॑ पता चललै छै कि एकरऽ आंतऽ के वातावरण म॑ एंटी-इंफ्लेमेटरी, एंटीऑक्सीडेंट, आरू एपिजेनेटिक रेगुलेटरी गुण छै ।[55] अध्ययनऽ स॑ पता चललै छै कि आईपीए आंतऽ के बाधा कार्य क॑ संतुलित करी सकै छै आरू ऑक्सीडेटिव तनाव क॑ कम करी सकै छै, जे एकरऽ स्थानीय शारीरिक प्रभाव म॑ योगदान द॑ सकै छै ।[56] वास्तव म॑, आईपीए क॑ परिसंचरण के माध्यम स॑ लक्षित अंगऽ म॑ पहुँचैलऽ जाय छै, आरू चूँकि आईपीए ट्रिप्टोफैन, सेरोटोनिन आरू इंडोल डेरिवेटिव के साथ एक समान प्रमुख मेटाबोलाइट संरचना साझा करै छै, ई लेली आईपीए चयापचय क्रिया करै छै जेकरऽ परिणामस्वरूप प्रतिस्पर्धी चयापचय भाग्य होय छै ।[52] आईपीए एंजाइम या रिसेप्टर्स पर बाइंडिंग साइट कें लेल ट्रिप्टोफैन सं निकलल मेटाबोलाइट्स सं प्रतिस्पर्धा कयर सकय छै, जे संभावित रूप सं सामान्य मेटाबोलिक मार्गक कें बाधित कयर सकय छै. ई एकरऽ चिकित्सीय खिड़की क॑ बेहतर ढंग स॑ समझै लेली एकरऽ फार्माकोकाइनेटिक्स आरू फार्माकोडायनामिक्स प॑ आगू के अध्ययन के जरूरत प॑ प्रकाश डालै छै.[57] देखना छै कि की ई हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल (HSCs) म॑ भी होय सकै छै ।
हम सब स्वीकार करैत छी जे हमर अध्ययन के किछु सीमा अछि। आईपीए सं संबंधित संघक कें विशेष रूप सं जांच करय कें लेल, हम टाइप 2 डायबिटीज मेलिटस (T2DM) कें मरीजक कें बाहर करल गेलय. हम स्वीकार करै छियै कि ई टाइप 2 डायबिटीज मेलिटस आरू एडवांस लिवर डिजीज के मरीजऽ प॑ हमरऽ निष्कर्षऽ के व्यापक प्रयोज्यता क॑ सीमित करी दै छै । यद्यपि मानव सीरम म॑ आईपीए केरऽ शारीरिक सांद्रता 1-10 μM [11, 20] छै, लेकिन 1 mM आईपीए केरऽ सांद्रता क॑ उच्चतम गैर-विषाक्त सांद्रता [15] आरू एपोप्टोसिस केरऽ सबसें अधिक दर के आधार प॑ चुनलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा म॑ नेक्रोटिक कोशिका आबादी केरऽ प्रतिशत म॑ कोनो अंतर नै छेलै । यद्यपि एहि अध्ययन मे आईपीए केर सुपरफिजियोलॉजिकल लेवल केर प्रयोग कयल गेल छल, मुदा वर्तमान मे आईपीए केर प्रभावी खुराक केर संबंध मे कोनो सहमति नहि अछि [52] । हालांकि हमरऽ परिणाम महत्वपूर्ण छै, लेकिन आईपीए केरऽ व्यापक चयापचय भाग्य शोध केरऽ सक्रिय क्षेत्र बनलऽ छै । एतबे नै, सीरम आईपीए स्तर आरू लिवर ट्रांसक्रिप्ट के डीएनए मिथाइलेशन के बीच संबंध पर हमरऽ निष्कर्ष न सिर्फ हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) स॑ बल्कि लिवर के ऊतकऽ स॑ भी प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै । हमनें ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण स॑ अपनऽ पिछला निष्कर्ष के आधार प॑ मानव एलएक्स-2 कोशिका के उपयोग करना चुनलकै कि आईपीए हेमेटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) सक्रियण स॑ जुड़लऽ छै [15], आरू एचएससी लिवर फाइब्रोसिस केरऽ प्रगति म॑ शामिल प्रमुख कोशिका छै । यकृत अनेक कोशिका प्रकार स॑ बनलऽ होय छै, ई लेली अन्य कोशिका मॉडल जेना कि हेपेटोसाइट-एचएससी-इम्यून कोशिका सह-संवर्धन प्रणाली क॑ कैस्पेस सक्रियण आरू डीएनए विखंडन के साथ-साथ प्रोटीन स्तर सहित क्रिया के तंत्र प॑ विचार करलऽ जाय ताकि आईपीए के भूमिका आरू अन्य यकृत कोशिका प्रकार के साथ एकरऽ बातचीत के अध्ययन करलऽ जाय ।