कोशिका के डिब्बाबंदी आ होमियोस्टेसिस के बनाए रखै के लेल स्राव मार्ग में प्रोटीन के छँटाई आवश्यक छै. खोल-मध्यस्थता वाला छँटाई के अलावा, स्राव परिवहन के प्रक्रिया म॑ किनेसिन छँटाई म॑ लिपिड के भूमिका एगो लंबा समय स॑ चलै वाला बुनियादी सवाल छै जेकरऽ जवाब अभी तलक नै मिललऽ छै । यहाँ, हम 3D एक साथ बहुरंगी उच्च-रिजोल्यूशन वास्तविक समय इमेजिंग प्रदर्शन इन विवो म॑ साबित करै लेली कि बहुत लम्बा सेरामाइड लिपिड अंश वाला नव संश्लेषित ग्लाइकोसाइलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल-स्थिर प्रोटीन क॑ समूहीकृत करी क॑ विशेष एंडोप्लाज्म म॑ वर्गीकृत करलऽ जाय छै नेट निकास साइट, जे ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन द्वारा उपयोग करलऽ जाय वाला स॑ अलग छै । एकरऽ अलावा, हमनी ई दर्शाबै छियै कि एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम झिल्ली म॑ सेरामाइड केरऽ श्रृंखला केरऽ लंबाई ई छँटाई चयनात्मकता लेली महत्वपूर्ण छै । हमरऽ अध्ययन लिपिड श्रृंखला केरऽ लंबाई के आधार प॑ प्रोटीन कार्गो क॑ स्राव मार्ग म॑ चयनात्मक निर्यात स्थल म॑ वर्गीकृत करै लेली पहलऽ प्रत्यक्ष इन विवो सबूत प्रदान करै छै ।
यूकेरियोटिक कोशिका म॑, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ER) म॑ संश्लेषित प्रोटीन क॑ तखन॑ स्राव मार्ग के माध्यम स॑ परिवहन के दौरान छाँटलऽ जाय छै ताकि ओकरऽ उचित कोशिकीय गंतव्य (1) प॑ पहुँचैलऽ जाय सक॑ । कोट-मध्यस्थता वाला छँटाई के अलावा, ई लंबा समय स॑ अनुमान लगाय देलऽ गेलऽ छेलै कि कुछ लिपिड ओकरा विशिष्ट झिल्ली डोमेन म॑ समूहीकृत करी क॑ चयनात्मक निकास बिंदु के रूप म॑ भी काम करी सकै छै कि विशिष्ट प्रोटीन (2-5) । लेकिन, अखनी भी ई संभावित लिपिड आधारित तंत्र क॑ साबित करै लेली प्रत्यक्ष इन विवो सबूत के कमी छै । ई मूलभूत समस्या के हल करै लेली हमन॑ खमीर म॑ ई अध्ययन करलकै कि ग्लाइकोसाइलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (जीपीआई) एंकर प्रोटीन (जीपीआई-एपी) क॑ ईआर स॑ कोना अंतर स॑ निर्यात करलऽ जाय छै । जीपीआई-एपी लिपिड स॑ जुड़लऽ कोशिका सतह प्रोटीन ( 6, 7) केरऽ एक किस्म छै । जीपीआई-एपी एकटा स्रावित प्रोटीन छै जे ग्लाइकोलिपिड अंश (जीपीआई एंकर) के माध्यम सं प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक सं जुड़ल छै. ई जीपीआई एंकर क॑ ईआर लुमेन म॑ रूढ़िवादी अनुवाद के बाद के संशोधन के रूप म॑ स्वीकार करै छै (8) । लगाव के बाद जीपीआई-एपी ईआर स॑ गोल्गी यंत्र (5, 9) स॑ प्लाज्मा झिल्ली म॑ जाय छै । जीपीआई एंकर केरऽ उपस्थिति के कारण जीपीआई-एपी क॑ स्राव मार्ग (5, 9, 10) के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन (अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन सहित) स॑ अलग परिवहन करलऽ जाय छै । खमीर कोशिका म॑, जीपीआई-एपी क॑ एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम म॑ अन्य स्रावित प्रोटीन स॑ अलग करलऽ जाय छै, आरू ओकरा बाद कोट प्रोटीन कॉम्प्लेक्स II (COPII) (6, 7) द्वारा लपेटलऽ गेलऽ अद्वितीय पुटिका म॑ पैक करलऽ जाय छै । ईआर निर्यात प्रक्रिया म॑ ई वर्गीकरण प्रक्रिया के निर्धारक अस्पष्ट छै, लेकिन ई अनुमान लगैलऽ जाय छै कि ई तंत्र लेली लिपिड के जरूरत पड़॑ सकै छै, खास करी क॑ जीपीआई एंकर ( 5 , 8 ) केरऽ लिपिड भाग के संरचनात्मक रिमोडलिंग । खमीर म॑ जीपीआई लिपिड रिमोडलिंग जीपीआई केरऽ संलग्न होय ​​के तुरंत बाद शुरू होय जाय छै, आरू बहुत मामला म॑, ई सेरामाइड क॑ 26-कार्बन लंबा श्रृंखला वाला संतृप्त फैटी एसिड (C26:0) (11, 12) स॑ जुड़ै के कारण बन॑ छै । C26 सेरामाइड एखन धरि खमीर कोशिका द्वारा उत्पादित मुख्य सेरामाइड अछि । एकरऽ संश्लेषण ईआर म॑ होय छै आरू एकरऽ अधिकांश भाग क॑ सीओपीआईआई पुटिका (13) के माध्यम स॑ गोल्गी यंत्र म॑ निर्यात करलऽ जाय छै । जीपीआई-एपी केरऽ ईआर निर्यात लेली विशेष रूप स॑ जारी सेरामाइड संश्लेषण (14, 15) केरऽ आवश्यकता छै, आरू बदला म॑, गोल्गी यंत्र म॑ सेरामाइड केरऽ इनोसिटोल फॉस्फेट सेरामाइड (आईपीसी) म॑ बदलना जीपीआई एंकर संश्लेषण (16) प॑ निर्भर करै छै । कृत्रिम झिल्ली के साथ जैव भौतिक अध्ययन स॑ पता चललै छै कि बहुत लम्बा एसिली श्रृंखला वाला सेरामाइड एकट्ठी होय क॑ अद्वितीय भौतिक गुण वाला क्रमबद्ध डोमेन बनाबै सकै छै ( 17 , 18 ). ई आंकड़ा ई परिकल्पना के तरफ ले जाय छै कि सी 26 सेरामाइड आरू सी 26 सेरामाइड के साथ जीपीआई-एपी अपनऽ भौतिक गुणऽ के उपयोग अपेक्षाकृत गन्दा ईआर झिल्ली लिपिड वातावरण म॑ व्यवस्थित क्षेत्र या क्षेत्र म॑ एकत्रित होय लेली करै छै । ई मुख्य रूप स॑ छोटऽ आरू असंतृप्त ग्लिसरॉलिपिड्स (C16:1 आरू C18:1) (19, 20) स॑ बनलऽ छै । ई क्षेत्रऽ क॑ चुनिंदा रूप स॑ विशिष्ट ईआर निकास साइट (ईआरईएस) प॑ केंद्रित करलऽ जैतै, जहां सेरामाइड आरू सेरामाइड आधारित जीपीआई-एपी क॑ एक ही समर्पित सीओपीआई पुटिका (5) म॑ गोल्गी म॑ सह-परिवहन करलऽ जाब॑ सकै छै ।
ई अध्ययन म॑ हमन॑ सीधे सुपर-रिजोल्यूशन कॉनफोकल रियल-टाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (SCLIM) के उपयोग करी क॑ ई लिपिड आधारित तंत्र के परीक्षण करलकै, जे एगो अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक छै जे एक साथ फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन के अवलोकन करी सकै छै तीन रंग आरू तीन आयामी (3D) छवि के जीवित कोशिका म॑ अत्यंत उच्च रिजोल्यूशन आरू गति छै (21, 22) ।
हमनें सबसें पहल॑ एससीएलआईएम तकनीक क॑ आरू परिभाषित करै लेली लागू करलकै कि एस. ईआर के वर्गीकरण के जांच के क्रम म॑, हमन॑ एक आनुवंशिक प्रणाली के उपयोग करलकै जे सीधे विवो म॑ ईआरईएस म॑ प्रवेश करै वाला नव संश्लेषित माल के कल्पना कर॑ सकै छै (7, 23) । कार्गो के रूप म॑, हमन॑ ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) स॑ लेबल C26 सेरामाइड आधारित GPI-AP Gas1 आरू निकट-अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन (iRFP) स॑ लेबल ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2 चुनलकै, जे दोनों प्लाज्मा झिल्ली (24-26) क॑ लक्षित करै छै । sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तित म॑ ई दूनू कार्गो गैलेक्टोज-प्रेरक प्रमोटर आरू एक संरचनात्मक ERES मार्कर के तहत व्यक्त करलऽ जाय छै । चरम तापमान (37°C) प॑, कैन्हेंकि sec31-1 उत्परिवर्तन COPII अंकुरण आरू ईआर निर्यात क॑ रोकै लेली COPII कोट घटक Sec31 केरऽ कार्य क॑ प्रभावित करै छै, ईआर (23) प॑ नव संश्लेषित माल जमा होय जाय छै । कम तापमान (24°C) प॑ ठंडा करला के बाद sec31-1 उत्परिवर्तित कोशिका स्राव क्षेत्र स॑ ठीक होय गेलै, आरू संचित नया सिंथेटिक माल क॑ ईआर स॑ निर्यात करना शुरू होय गेलै । सीएलआईएम विजुअलाइजेशन स॑ पता चललै कि नव संश्लेषित Gas1-GFP आरू Mid2-iRFP केरऽ अधिकांश भाग 37°C प॑ ऊष्मायन के बाद भी sec31-1 उत्परिवर्तित कोशिका केरऽ ईआर म॑ जमा होय जाय छै आरू ओकरा बाद 24°C प॑ 5 मिनट तलक रिलीज होय जाय छै (चित्र 1) । चूँकि Mid2-iRFP पूरा ईआर झिल्ली प॑ वितरित होय छै, आरू Gas1-GFP असंतत ईआर झिल्ली क्षेत्र म॑ केंद्रित आरू एकत्रित होय छै, ई लेली ओकरऽ वितरण बिल्कुल अलग होय छै (चित्र 1, ए स॑ सी आरू मूवी एस1) । एकरऽ अलावा, जैना कि चित्र 1D म॑ दिखालऽ गेलऽ छै, Gas1-GFP क्लस्टर म॑ Mid2-iRFP नै छै । ई परिणाम संकेत करै छै कि जीपीआई-एपी आरू ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन क॑ जल्दी अलग-अलग ईआर झिल्ली क्षेत्र म॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै । Gas1-GFP समूह mCherry केरऽ COPII कोट प्रोटीन Sec13 (चित्र 1, ई आरू एफ, आरू फिल्म S1) (23) स॑ लेबल करलऽ गेलऽ एक विशिष्ट ERES स॑ सटलऽ छै ।
sec31-1 कोशिका गैलेक्टोज-प्रेरित स्राव क॑ व्यक्त करै छै, एक लम्बी एसिली श्रृंखला (C26) सेरामाइड GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ग्रीन) आरू ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन Mid2-iRFP (TMP, नीला) आरू ई रचनात्मक ईआरईएस लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, मैजेंटा) क॑ 37°C प॑ 30 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा म॑ स्थानांतरित करलऽ गेलऽ छेलै 24°C, आरू SCLIM द्वारा 5 मिनट बाद इमेजिंग करलऽ गेलऽ छै । (A to C) एक विमान (A) केरऽ प्रतिनिधि मर्ज या एकल 2D छवि, 10 z-खंड (B) केरऽ 2D प्रोजेक्शन छवि या माल आरू ERES मार्कर (C) केरऽ 3D कोशिका गोलार्ध छवि दिखाबै छै । पैमाने बार 1μm (ए और बी)। पैमाना इकाई 0.551μm (C) अछि । Gas1-GFP क॑ असतत ईआर क्षेत्र या समूह म॑ पता चललै, जबकि Mid2-iRFP केरऽ पता लगाय क॑ पूरा ईआर झिल्ली (सी) म॑ वितरित करलऽ गेलऽ छेलै । (D) ग्राफ सफेद तीर रेखा (बाएं) के साथ Gas1-GFP समूह म॑ Gas1-GFP आरू Mid2-iRFP केरऽ सापेक्षिक प्रतिदीप्ति तीव्रता क॑ दर्शाबै छै । एयू, मनमाना इकाई। (ई आ एफ) 3D छवि कें प्रतिनिधित्व करयत छै जे माल आ ईआरईएस निशान कें संयोजन करयत छै. विशिष्ट ईआरईएस के पास गैस1-जीएफपी क्लस्टर के पता चलल छल. पैमाना इकाई 0.551μm अछि। (F) सफेद ठोस तीर ERES स॑ जुड़लऽ Gas1-GFP समूह क॑ चिह्नित करै छै । बीच आरू दाहिना पैनल म॑ मर्ज करलऽ गेलऽ बढ़लऽ 3D छवि आरू चयनित Gas1-GFP क्लस्टर केरऽ घुमायलऽ दृश्य दिखालऽ गेलऽ छै ।
Gas1-GFP समूह आरू एक विशिष्ट ERES के बीच घनिष्ठ स्थानिक संबंध संकेत करै छै कि Gas1-GFP चयनात्मक ERES म॑ प्रवेश करी सकै छै, जे Mid2-iRFP द्वारा ईआर स॑ बाहर निकलै लेली उपयोग करलऽ जाय वाला चयनात्मकता स॑ अलग छै । एहि संभावना कए संबोधित करबा लेल हम केवल एक या दूटा वस्तु क लेल ईआरईएस अनुपात कए मात्रा निर्धारित केलहुं (चित्र 2, ए स सी)। हमनें पाया कि अधिकांश ईआरईएस (70%) मे केवल एक प्रकार कें माल होयत छै. चित्र 2C केरऽ निचला छवि म॑ केवल Gas1-GFP (चित्र 1) या केवल Mid2-iRFP (चित्र 2) के साथ ERES केरऽ दू विशिष्ट उदाहरण दिखालऽ गेलऽ छै । एकरऽ विपरीत लगभग २०% ईआरईएस म॑ दू माल छै जे एक ही क्षेत्र म॑ ओवरलैप होय जाय छै । पता चललै कि कुछ ईआरईएस (10%) म॑ दू तरह के माल छेलै, लेकिन ई स्पष्ट रूप स॑ अलग-अलग क्षेत्रऽ म॑ अलग-थलग छेलै । अतः ई सांख्यिकीय विश्लेषण स॑ पता चलै छै कि ईआर निर्यात करला के बाद जीपीआई-एपी गैस1-जीएफपी आरू ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो मिड2-आईआरएफपी क॑ अलग-अलग ईआरईएस म॑ विभाजित करलऽ जाय छै (चित्र 2डी) । ई छँटाई दक्षता पिछला जैव रासायनिक विश्लेषण (6) आरू रूपात्मक निर्धारण (7) के साथ बहुत संगत छै । हम ईआरईएस मे प्रवेश करय वाला क्वारंटाइन मे राखल गेल माल कें व्यवहार कें सेहो देख सकय छी (चित्र 2ई आ मूवी एस2)। चित्र 2E दर्शा रहल छै कि Gas1-GFP (पैनल 3) या Mid2-iRFP (पैनल 4) कें केवल एकटा छोट हिस्सा एक तरफ सं ERES मे प्रवेश करय छै आ एकटा असतत क्षेत्र मे सीमित छै. चित्र 2E केरऽ पैनल 5 स॑ पता चलै छै कि Gas1-GFP आरू Mid2-iRFP कखनी-कखनी एक ही ERES म॑ मिलै छै, लेकिन ई अलग-अलग तरफ स॑ प्रवेश करै छै आरू अलग-अलग क्षेत्रऽ म॑ केंद्रित होय छै जे अलग-अलग COPII पुटिका के प्रतिनिधित्व करी सकै छै । हमनें ई भी पुष्टि करलकै कि चयनात्मक ERES के रूप म॑ C26 सेरामाइड आधारित GPI-AP Gas1 केरऽ देखलऽ गेलऽ पृथक्करण आरू वर्गीकरण विशिष्ट छै, कैन्हेंकि एगो आरू ट्रांसमेम्ब्रेन स्राव कार्गो, GFP-टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन Axl2 (27 ), Mid2-iRFP के समान व्यवहार दिखाबै छै । (चित्र S1 आ मूवी S3)। नव संश्लेषित Axl2-GFP Mid2-iRFP (चित्र S1, A आरू B) जैसनऽ ईआर झिल्ली के माध्यम स॑ वितरित होय छै, आरू अधिकांश ERES म॑ Mid2-iRFP के साथ सह-स्थानीय होय छै (चित्र S1, B स॑ D) । चित्र 1 कें पैनल 1 आ 2.S1C ERES कें दू विशिष्ट उदाहरण दर्शा रहल छै जतय दू ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो ओवरलैप भ जायत छै. अइ मामलाक मे दूनू माल एक संगे ईआरईएस मे प्रवेश करय छै (चित्र S1E, पैनल 3 आ मूवी S3)।
गैलेक्टोज प्रेरक स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, ग्रीन) आरू Mid2-iRFP (TMP, नीला) आरू संरचनात्मक ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, मैजेंटा) क॑ व्यक्त करय वाला sec31-1 कोशिका क॑ °C प॑ 30 मिनट तलक इन्क्यूबेशन के बाद 37 प॑ रखलऽ गेलऽ छेलै, स्राव ब्लॉक क॑ रिलीज करै लेली 24 °C प॑ ले जायलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरऽ बाद SCLIM स॑ इमेज करलऽ गेलऽ छेलै २० मिनट के। (ए स॑ सी) माल केरऽ प्रतिनिधि 2D प्रक्षेपण छवि (ए; पैमाने बार, 1μm) या 3D कोशिका गोलार्ध छवि (बी आरू सी; पैमाने इकाई, 0.456μm) आरू ईआरईएस द्वारा चिह्नित 10 z-अनुभाग. (B) म॑ निचला पैनल आरू (C) म॑ पैनल प्रोसेस्ड छवि क॑ प्रदर्शित करै छै ताकि केवल ईआरईएस (मैजेंटा) [Gas1-GFP (ग्रे) आरू Mid2-iRFP (हल्का नीला)] म॑ मौजूद सामान क॑ प्रदर्शित करलऽ जाय सक॑ । (C) खुला तीर : ईआरईएस केवल एकटा माल कें टुकड़ा (1 सं 4) ल क चलएयत छै. ग्रे तीर : ईआरईएस मे अलग-थलग माल (5) होयत छै. सफेद ठोस तीर: सह-स्थापित माल युक्त ईआरईएस। नीचाँ: चयनित एकल ईआरईएस मे केवल Gas1-GFP (1) या Mid2-iRFP (2) होयत छै. पैमाने पर बार, 100 एनएम। (D) (C) मे वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ की मात्रा निर्धारण | ईआरईएस कें औसत प्रतिशत जेकरा मे केवल एकटा माल (गैस1-जीएफपी या मिड2-आईआरएफपी), अलग-अलग माल आ ओवरलैपिंग माल होयत छै. तीन स्वतंत्र प्रयोगों में, 54 कोशिकाओं में n = 432 | त्रुटि बार = एसडी। दू पूंछ वाला अयुग्मित टी परीक्षण। *** पी = 0.0002। (ई) क्वारंटाइन कैल गेल माल कें चयनित ईआरईएस कें 3D छवि (सी) सं चिह्नित. Gas1-GFP (हरा) (3) या Mid2-iRFP (नीला) (4) एक तरफ सं ERES (मैजेंटा) मे प्रवेश करयत छै आ ERES कें भीतर एकटा छोट क्षेत्र तइक सीमित छै. कखनों-कखनों, दूनू प्रकार कें माल एकहि तरफ सं एकहि ईआरईएस (5) मे प्रवेश करयत छै आ ईआरईएस कें भीतर कोनों अलग-थलग क्षेत्र मे सीमित रहयत छै. पैमाने पर बार, 100 एनएम।
अगला, हमनें एक परिकल्पना के परीक्षण करलकै कि ईआर झिल्ली म॑ मौजूद लंबा एसिली चेन सेरामाइड (C26) Gas1 केरऽ विशिष्ट समूहीकरण आरू छँटाई क॑ चयनात्मक ईआरईएस म॑ चलाबै छै । एकरा लेली, हमन॑ एक संशोधित खमीर तनाव GhLag1 के प्रयोग करलकै, जेकरा म॑ दू अंतर्जात सेरामाइड सिन्थेज Lag1 आरू Lac1 क॑ GhLag1 (कपास केरऽ Lag1 होमोलॉग) स॑ बदललऽ गेलऽ छेलै, जेकरऽ परिणामस्वरूप जंगली प्रकार स॑ छोटऽ कोशिका झिल्ली सेरामाइड तनाव वाला खमीर तनाव पैदा होय गेलऽ छेलै (चित्र 3A) (28) । मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) विश्लेषण स॑ पता चललै कि जंगली प्रकार के उपभेदऽ म॑ कुल सेरामाइड के ९५% बहुत लम्बा (C26) श्रृंखला वाला सेरामाइड होय छै, जबकि GhLag1 म॑ ८५% सेरामाइड बहुत लम्बा (C18 आरू C16) होय छै । ), सेरामाइड केरऽ मात्र २% बहुत लम्बा (C26) श्रृंखला वाला सेरामाइड होय छै । हालांकि C18 आरू C16 सेरामाइड अभी तलक GhLag1 झिल्ली म॑ पता चललऽ मुख्य सेरामाइड छै, लेकिन एमएस विश्लेषण स॑ ई भी पुष्टि होय गेलै कि GhLag1 तनाव म॑ व्यक्त करलऽ गेलऽ Gas1-GFP केरऽ GPI एंकर म॑ C26 सेरामाइड छै, जे जंगली प्रकार के लिपिड स॑ तुलनीय छै । गुण एके रंग अछि (चित्र 3 क) (26)। अतः एकरऽ मतलब छै कि सेरामाइड रिमोडलिंग एंजाइम Cwh43 C26 सेरामाइड लेली बहुत चयनात्मक छै, जैसनऽ कि चित्र 26 म॑ दिखालऽ गेलऽ छै, ई प्राथमिकता स॑ GhLag1 तनाव म॑ C26 सेरामाइड केरऽ थोड़ऽ मात्रा स॑ जीपीआई एंकर क॑ शामिल करै छै । एस 2 (29)। एकरऽ बावजूद GhLag1 केरऽ कोशिका झिल्ली म॑ मूल रूप स॑ केवल C18-C16 सेरामाइड होय छै, जबकि Gas1-GFP म॑ अखनी भी C26 सेरामाइड होय छै । ई तथ्य ई तनाव क॑ ईआर म॑ झिल्ली सेरामाइड केरऽ एसिली चेन लंबाई के समस्या क॑ विशेष रूप स॑ हल करै लेली एगो आदर्श उपकरण बनाबै छै । वर्ग एवं छँटाई की काल्पनिक भूमिका। तखन, हमनें सबसें पहलऽ पारंपरिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के माध्यम स॑ sec31-1 केरऽ तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तित एलील के साथ GhLag1 म॑ समूह म॑ जमा होय के C26 Gas1-GFP केरऽ क्षमता के अध्ययन करलकै, जहाँ ईआर झिल्ली सेरामाइड (चित्र 3) म॑ केवल लंबा (C18-C16) श्रृंखला मौजूद छै । हमनें देखलकै कि sec31-1 म॑, अधिकांश Gas1-GFP समूहऽ म॑ केंद्रित छेलै, जबकि sec31-1 GhLag1 म॑ Gas1-GFP लंबा (C18-C16) लंबा सेरामाइड ईआर झिल्ली के साथ मुख्य रूप स॑ समूहबद्ध नै छेलै आरू पूरा ईआर झिल्ली म॑ वितरित नै छेलै । सटीक कहै लेली, कैन्हेंकि C26 सेरामाइड आधारित क्लस्टरिंग विशिष्ट ईआरईएस (चित्र 1) स॑ गहराई स॑ संबंधित छै, हमन॑ अगला जांच करलकै कि की ई प्रक्रिया म॑ ईआर निर्यात प्रोटीन तंत्र केरऽ कार्य भी शामिल होय सकै छै । जीपीआई-एपी ईआर निर्यात के लेलऽ एगो विशेष सीओपीआईआई प्रणाली के उपयोग करै छै, जे सक्रिय रूप स॑ जीपीआई एंकर (30, 31) के ग्लाइकन भाग के Ted1 के संरचनात्मक रिमोडलिंग द्वारा नियंत्रित होय छै । तखन पुनर्संयोजित जीपीआई-ग्लाइकन क॑ ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर p24 परिसर द्वारा पहचानलऽ जाय छै, जे बदला म॑ चुनिंदा रूप स॑ Lst1 क॑ भर्ती करै छै, जे प्रमुख COPII कार्गो बाइंडिंग सबयूनिट Sec24 केरऽ एगो विशिष्ट आइसोफॉर्म छै, जेकरा स॑ एक GPI-AP-समृद्ध COPII पुटिका आवश्यक छै (31-33) । अतः, हमनें एक डबल उत्परिवर्तित के निर्माण करलकै जे ई एकल प्रोटीन (p24 जटिल घटक Emp24, GPI-ग्लाइकन रिमोडलिंग एंजाइम Ted1 आरू विशिष्ट COPII सबयूनिट Lst1) के विलोपन क॑ sec31-1 उत्परिवर्तित तनाव के साथ जोड़लकै, आरू ओकरऽ अध्ययन करलकै कि Is it possible to form Gas1-cluster GFP (चित्र 3) । हमनें देखलकै कि sec31-1emp24Δ आरू sec31-1ted1Δ म॑ Gas1-GFP मुख्य रूप स॑ अनक्लस्टर आरू पूरा ईआर झिल्ली म॑ वितरित छै, जैसनऽ कि पहले sec31-1 GhLag1 म॑ देखलऽ गेलऽ छेलै, जबकि sec31-1lst1Δ म॑, Gas1-GFP Like sec31-1 । ई परिणाम संकेत करै छै कि ईआर झिल्ली म॑ C26 सेरामाइड केरऽ उपस्थिति के अलावा, Gas1-GFP केरऽ क्लस्टरिंग क॑ भी p24 परिसर स॑ जुड़ै के जरूरत छै, आरू एकरा लेली विशिष्ट Lst1 भर्ती के जरूरत नै छै । तखन, हमनें ई संभावना के खोज करलकै कि ईआर झिल्ली म॑ सेरामाइड केरऽ श्रृंखला लंबाई Gas1-GFP केरऽ p24 स॑ बाइंडिंग क॑ नियंत्रित करी सकै छै । लेकिन, हमनें पाया कि झिल्ली म॑ C18-C16 सेरामाइड केरऽ उपस्थिति p24 परिसर (चित्र S3 आरू S4, A आरू B) द्वारा पुनर्निर्माण करलऽ गेलऽ GPI-ग्लाइकन या GPI-AP स॑ जुड़ना आरू GPI-AP क॑ निर्यात करै वाला क॑ प्रभावित नै करै छै । योग्यता। भर्ती COPII उपप्रकार Lst1 (चित्र S4C)। अतः, C26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिंग क॑ अलग-अलग ईआर निर्यात प्रोटीन तंत्र के साथ प्रोटीन बातचीत के जरूरत नै छै, लेकिन लिपिड लंबाई स॑ संचालित वैकल्पिक छँटाई तंत्र के समर्थन करै छै । तखन, हमनें विश्लेषण करलकै कि ईआर झिल्ली म॑ सेरामाइड एसिल श्रृंखला केरऽ लंबाई चयनात्मक ईआरईएस के रूप म॑ Gas1-GFP केरऽ प्रभावी वर्गीकरण लेली महत्वपूर्ण छै कि नै । चूँकि छोट श्रृंखला वाला सेरामाइड वाला GhLag1 तनाव म॑ Gas1 ईआर स॑ बाहर निकली क॑ प्लाज्मा झिल्ली म॑ प्रवेश करै छै (चित्र S5), हमरऽ मानना ​​छै कि अगर छँटाई सेरामाइड एसिली श्रृंखला केरऽ लंबाई स॑ संचालित होय छै त॑ GhLag1 तनाव म॑ Gas1 क॑ पुनर्निर्देशित करी क॑ पार करलऽ जाब॑ सकै छै । एकहि झिल्ली के साथ ईरेस माल।
(A) GhLag1 केरऽ कोशिका झिल्ली म॑ मुख्य रूप स॑ छोटऽ C18-C16 सेरामाइड होय छै, जबकि Gas1-GFP केरऽ GPI एंकर म॑ अखनी भी जंगली प्रकार के कोशिका के समान C26 आईपीसी छै । ऊपर: मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारा जंगली-प्रकार (Wt) आरू GhLag1p उपभेदों के कोशिका झिल्ली म॑ सेरामाइड के एसिली श्रृंखला लंबाई विश्लेषण । आंकड़ा कुल सेरामाइड के प्रतिशत के प्रतिनिधित्व करै छै. तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत। त्रुटि बार = एसडी। दू पूंछ वाला अयुग्मित टी परीक्षण। **** पी <0.0001। निचला पैनल: जंगली प्रकार आरू GhLag1p उपभेद म॑ व्यक्त Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI एंकर म॑ मौजूद आईपीसी केरऽ एसिली श्रृंखला लंबाई के एमएस विश्लेषण । डाटा कुल आईपीसी सिग्नल कें प्रतिशत कें प्रतिनिधित्व करयत छै. पांच स्वतंत्र प्रयोगों के औसत। त्रुटि बार = एसडी। दू पूंछ वाला अयुग्मित टी परीक्षण। ns, महत्वपूर्ण नहि। पी = 0.9134। (B) गैलेक्टोज-प्रेरित Gas1-GFP व्यक्त करय वाला sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ आरू sec31-1lst1Δ कोशिका के प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ क॑ 37 डिग्री सेल्सियस प॑ 30 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै आरू ओकरा बाद नियमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करै लेली नीचे पास करलऽ गेलऽ छेलै २४ डिग्री सेल्सियस। सफेद तीर: ईआर गैस1-जीएफपी समूह। खुला तीर: अनक्लस्टर गैस1-जीएफपी पूरा ईआर झिल्ली पर वितरित छै, जे ईआर विशेषता न्यूक्लियर रिंग धुंधलापन दर्शाबै छै. पैमाने पर बार, 5μm। (C) (B) मे वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ की मात्रा निर्धारण | विरामयुक्त Gas1-GFP संरचना के साथ कोशिकाओं के औसत प्रतिशत | तीन स्वतंत्र प्रयोगों में, n≥300 कोशिकाओं। त्रुटि बार = एसडी। दू पूंछ वाला अयुग्मित टी परीक्षण। **** पी <0.0001।
सीधे इस समस्या क॑ हल करै लेली, हमन॑ sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तित एलील (चित्र 4 आरू मूवी S4) के साथ GhLag1 म॑ Gas1-GFP आरू Mid2-iRFP केरऽ SCLIM विजुअलाइजेशन करलकै । ईआर क॑ 37°C प॑ रखला के बाद आरू बाद म॑ 24°C प॑ रिलीज करला के बाद, नव संश्लेषित Gas1-GFP केरऽ अधिकांश भाग क॑ समूहबद्ध नै करलऽ गेलऽ छेलै आरू पूरा ईआर झिल्ली म॑ वितरित नै करलऽ गेलऽ छेलै, जैसनऽ कि पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी (चित्र 4, ए आरू बी) द्वारा देखलऽ गेलऽ छेलै । एकरऽ अलावा ईआरईएस केरऽ एगो बड़ऽ प्रतिशत (67%) म॑ दू तरह के माल शामिल छै जे ओकरा म॑ सह-स्थापित छै (चित्र 4D) । चित्र 4C कें पैनल 1 आ 2 ओवरलैपिंग Gas1-GFP आ Mid2-GFP कें साथ ERES कें दू विशिष्ट उदाहरणक कें दर्शा रहल छै. एकरऽ अलावा दूनू माल क॑ एक ही ईआरईएस (चित्र 4ई, पैनल 3 आरू मूवी एस4) म॑ भर्ती करलऽ गेलऽ छेलै । अतः हमरऽ परिणाम संकेत करै छै कि ईआर झिल्ली म॑ सेरामाइड एसिल श्रृंखला केरऽ लंबाई ईआर प्रोटीन केरऽ एकत्रीकरण आरू वर्गीकरण केरऽ एगो महत्वपूर्ण निर्धारक छै ।
गैलेक्टोज-प्रेरित स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, हरे) आरू Mid2-iRFP (TMP, नीला) आरू संरचनात्मक ERES-लेबल Sec13-mCherry (ERES, मैजेंटा) व्यक्त करय वाला Sec31-1 GhLag1 कोशिका 37°C पर इन्क्यूबेट कर॑ छै. 30 मिनट धरि जारी राखू, स्राव छोड़बाक लेल 24°C पर छोड़ू, आ 20 मिनटक बाद SCLIM सँ इमेज करू । (ए स॑ सी) कार्गो आरू ईआरईएस द्वारा चिह्नित 10 जेड-खंडऽ के प्रतिनिधि 2D प्रक्षेपण छवि (ए; पैमाने बार, 1μm) या 3D कोशिका गोलार्ध छवि (बी आरू सी; पैमाने इकाई, 0.45μm) । (B) म॑ निचला पैनल आरू (C) म॑ पैनल प्रोसेस्ड छवि क॑ प्रदर्शित करै छै ताकि केवल ईआरईएस (मैजेंटा) [Gas1-GFP (ग्रे) आरू Mid2-iRFP (हल्का नीला)] म॑ मौजूद सामान क॑ प्रदर्शित करलऽ जाय सक॑ । (C) सफेद भरा तीर: ईरेस, माल ओवरलैप। खुजल तीर: ईआरईएस मे मात्र एकटा आइटम अछि। निचला पैनल: चयनित ईआरईएस मे (सी) मे चिह्नित ओवरलैपिंग माल (1 आ 2) छै. पैमाने पर बार, 100 एनएम। (D) (C) मे वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ की मात्रा निर्धारण | sec31-1 आ sec31-1 GhLag1 इकाइयक मे, केवल एकटा कार्गो (Gas1-GFP या Mid2-iRFP) शामिल छै, आ अलग-थलग माल आ ओवरलैपिंग कार्गो कें लेल ईआरईएस कें औसत प्रतिशत. तीन स्वतंत्र प्रयोगों म॑ 54 कोशिका (sec31-1) म॑ n = 432 आरू 47 कोशिका (sec31-1 GhLag1) म॑ n = 430 । त्रुटि बार = एसडी। दू पूंछ वाला अयुग्मित टी परीक्षण। *** पी = 0.0002 (sec31-1) और ** पी = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)। (ई) (सी) मे चिह्नित ओवरलैपिंग कार्गो (3) कें साथ चयनित ईआरईएस कें 3D छवि. गैस1-जीएफपी (हरा) आ मिड2-आईआरएफपी (नीला) एकहि तरफ सं ईआरईएस (मैजेंटा) कें नजदीक आबय छै आ एकहि ईआरएस प्रतिबंधित क्षेत्र मे रहय छै. पैमाने पर बार, 100 एनएम।
ई अध्ययन सीधा इन विवो सबूत प्रदान करै छै कि लिपिड आधारित प्रोटीन कार्गो क॑ स्राव मार्ग म॑ चयनात्मक निर्यात स्थल म॑ वर्गीकृत करलऽ जाय छै, आरू वर्गीकरण चयनात्मकता लेली एसिली श्रृंखला लंबाई के महत्व के खुलासा करै छै । SCLIM नामक एक शक्तिशाली आरू अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक के उपयोग करी क॑ हमन॑ खमीर म॑ नव संश्लेषित Gas1-GFP (एक प्रमुख प्लाज्मा झिल्ली GPI-AP के साथ एक बहुत लम्बा एसिली श्रृंखला (C26) सेरामाइड लिपिड भाग) के प्रदर्शन करलकै ) असतत ईआर म॑ समूहबद्ध क्षेत्र विशिष्ट ERES स॑ जुड़लऽ छै, जबकि ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन पूरा ईआर झिल्ली के माध्यम स॑ वितरित छै (चित्र 1)। एकर अलावा, इ दूनू प्रकार कें माल अलग-अलग ईआरईएस मे चुनिंदा रूप सं प्रवेश करय छै (चित्र 2)। झिल्ली म॑ कोशिकीय सेरामाइड केरऽ एसिल श्रृंखला केरऽ लंबाई C26 स॑ C18-C16 तलक कम होय जाय छै, Gas1-GFP समूह क॑ असतत ईआर क्षेत्र म॑ बाधित होय जाय छै, आरू Gas1-GFP क॑ एक ही ERES के माध्यम स॑ ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के साथ ईआर स॑ बाहर निकलै लेली पुनः मार्गबद्ध करलऽ जाय छै (चित्र 3 आरू चित्र 3) । 4)।
यद्यपि जीपीआई-एपी ईआर स॑ बाहर निकलै लेली एगो विशेष प्रोटीन तंत्र के उपयोग करै छै, लेकिन हमन॑ पालै छै कि सी 26 सेरामाइड-निर्भर पृथक्करण विभेदक प्रोटीन बातचीत प॑ निर्भर नै छै जे ईआरईएस विशेषज्ञता के तरफ ले जाय सकै छै (चित्र S4 आरू S5) । बल्कि, हमरऽ निष्कर्ष लिपिड आधारित प्रोटीन क्लस्टरिंग आरू बाद म॑ अन्य माल केरऽ बहिष्कार द्वारा संचालित वैकल्पिक वर्गीकरण तंत्र के समर्थन करै छै । हमरऽ अवलोकन संकेत करै छै कि Gas1-GFP क्षेत्र या एक विशिष्ट ERES स॑ जुड़लऽ समूह म॑ ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2-iRFP के कमी छै, जे संकेत करै छै कि C26 सेरामाइड-निर्भर GPI-AP समूह संबंधित ERES म॑ ओकरऽ प्रवेश क॑ सुविधाजनक बनाबै छै, आरू साथ ही साथ, ट्रांसमेम्ब्रेन क॑ बाहर करी देतै स्राव ई विशेष ERES म॑ प्रवेश करै छै (चित्र 1 आरू 2) । एकरऽ विपरीत, ईआर झिल्ली म॑ C18-C16 सेरामाइड केरऽ उपस्थिति स॑ जीपीआई-एपी क्षेत्र या समूह नै बनाबै छै, ई लेली ई ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन क॑ एक ही ईआरईएस म॑ बाहर नै करै छै या बदलै छै (चित्र 3 आरू 4) । . अतः, हम प्रस्ताव दै छै कि C26 सेरामाइड विशिष्ट ईआरईएस स॑ जुड़लऽ प्रोटीनऽ के समूहीकरण क॑ सुविधाजनक बनाबै स॑ पृथक्करण आरू वर्गीकरण क॑ संचालित करै छै ।
एकटा विशिष्ट ईआर क्षेत्र मे इ C26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिंग कोना प्राप्त कैल जै? झिल्ली सेरामाइड केरऽ पार्श्विक रूप स॑ अलग होय के प्रवृत्ति के कारण ईआर झिल्ली केरऽ अधिक अनियमित लिपिड वातावरण म॑ छोटऽ आरू असंतृप्त ग्लिसरॉलिपिड वाला जीपीआई-एपी आरू सी२६ सेरामाइड छोटऽ आरू तुरंत क्रमबद्ध लिपिड बनी सकै छै । गुणवत्ता समूह (17, 18)। ई छोटऽ अस्थायी समूहऽ क॑ p24 परिसर ( 34 ) स॑ जुड़ला के बाद आरू बड़ऽ, अधिक स्थिर समूहऽ म॑ फ्यूज करलऽ जाब॑ सकै छै । एकरऽ अनुरूप, हमन॑ देखैलकै कि C26 Gas1-GFP क॑ p24 परिसर के साथ बातचीत करी क॑ बड़ऽ दृश्यमान समूह (चित्र 3) बनाबै के जरूरत छै । p24 परिसर एक विषमयुग्मज ओलिगोमर छै जे खमीर (35) म॑ चार अलग-अलग p24 ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन स॑ बनलऽ छै, जे बहुसंयोजक बाइंडिंग प्रदान करै छै, जेकरा स॑ छोटऽ जीपीआई-एपी समूहऽ के क्रॉस-लिंकिंग होय सकै छै, जेकरा स॑ बड़ऽ स्थिर समूह (34) पैदा होय सकै छै । जीपीआई-एपी केरऽ प्रोटीन एक्टोडोमेन के बीच बातचीत भी ओकरऽ एकत्रीकरण म॑ योगदान द॑ सकै छै, जैसनऽ कि स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका म॑ ओकरऽ गोल्गी परिवहन के दौरान दिखालऽ गेलऽ छै ( 36 ). लेकिन जब॑ ईआर झिल्ली म॑ C18-C16 सेरामाइड मौजूद होय छै, त॑ जब॑ p24 परिसर Gas1-GFP स॑ जुड़ै छै त॑ बड़ऽ अलग-अलग समूह नै बनतै । अंतर्निहित तंत्र लंबा एसिली श्रृंखला वाला सेरामाइड के विशिष्ट भौतिक आरू रासायनिक गुणऽ प॑ निर्भर करी सकै छै । कृत्रिम झिल्ली के जैव भौतिक अध्ययन स॑ पता चलै छै कि भले ही लम्बा (C24) आरू छोटऽ (C18-C16) एसिली श्रृंखला के सेरामाइड दूनू चरण पृथक्करण के कारण बनी सकै छै, लेकिन केवल लम्बा एसिल श्रृंखला वाला सेरामाइड (C24) ही फिल्म क॑ नया आकार दै लेली उच्च वक्रता आरू फिल्म झुकना क॑ बढ़ावा द॑ सकै छै । आपसी संदर्भ (17, 37, 38) के माध्यम से। ई देखलऽ गेलऽ छै कि Emp24 केरऽ मानव समरूप TMED2 केरऽ ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स कोशिका द्रव्य लोब्यूल म॑ C18 सेरामाइड आधारित स्फिंगोमाइलिन के साथ चुनिंदा रूप स॑ बातचीत करै छै ( 39 ). आणविक गतिकी (एमडी) सिमुलेशन के उपयोग करी क॑ हमन॑ पालै छै कि C18 आरू C26 दोनों सेरामाइड Emp24 ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स केरऽ साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल के आसपास जमा होय जाय छै, आरू ओकरऽ वरीयता समान छै (चित्र S6) । ध्यान देबऽ के बात छै कि ई संकेत करै छै कि Emp24 केरऽ ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स झिल्ली म॑ लिपिड केरऽ असममित वितरण के कारण बनी सकै छै । ई स्तनधारी कोशिका पर आधारित हाल के परिणाम छै. एहने एमडी सिमुलेशन ईथर लिपिड (40) केर उपस्थिति सेहो देखबैत अछि । अतः हम अनुमान लगाबैत छी जे ईआर२६ केरऽ दू लोब्यूल म॑ सी२६ सेरामाइड स्थानीय रूप स॑ समृद्ध छै । जब॑ लुमिनल लोब्यूल म॑ जीपीआई-एपी सीधे बहुसंयोजक पी२४ स॑ जुड़ै छै आरू साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल म॑ पी२४ के आसपास सी२६ सेरामाइड के संचय होय जाय छै, त॑ ई साथ म॑ प्रोटीन केरऽ एकत्रीकरण क॑ बढ़ावा द॑ सकै छै आरू झिल्ली के वक्रता आँगुरऽ के माध्यम स॑ उत्पन्न होय ​​जाय छै (41), जेकरा स॑ जीपीआई-एपी ईआरईएस स॑ सटलऽ असतत क्षेत्रऽ म॑ अलग होय जाय छै, जे भी उच्च वक्रता के पक्ष म॑ होय छै ईआर झिल्ली ( 42 ) के क्षेत्र। पिछला रिपोर्ट प्रस्तावित तंत्र (43, 44) क समर्थन केलक। प्लाज्मा झिल्ली पर सेरामाइड आधारित ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड (GSL) के प्रति ओलिगोलेक्टिन, रोगजनक या एंटीबॉडी के बहुसंयोजक बाइंडिंग पैघ जीएसएल एकत्रीकरण के ट्रिगर करैत अछि, चरण पृथक्करण के बढ़ाबैत अछि आ झिल्ली के विरूपण आ आंतरिकीकरण के कारण बनैत अछि ( 44 ). इवाबुची आदि (43) ई पाबै गेलै कि लम्बा (C24) लेकिन छोटऽ नै (C16) एसिली श्रृंखला के उपस्थिति म॑ जीएसएल लैक्टोसाइलसेरामाइड स॑ जुड़लऽ बहुसंयोजक लाइगैंड न॑ बड़ऽ समूह आरू झिल्ली केरऽ आक्रमण के प्रेरणा देलकै, आरू पत्रकऽ प॑ कोशिका द्रव्य लिन-मध्यस्थता वाला संकेत संप्रेषण क॑ युग्मित म॑ एसिल श्रृंखला द्वारा इंटरडिजिटेशन करलऽ जाय छै न्यूट्रोफिल के।
स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका म॑, एपिकल प्लाज्मा झिल्ली केरऽ स्तर तलक एंटी-गोल्गी नेटवर्क (टीजीएन) केरऽ एकाग्रता जीपीआई-एपी (10, 45) केरऽ पृथक्करण आरू छंटाई क॑ नियंत्रित करै छै । ई एकत्रीकरण जीपीआई-एपी ओलिगोमेराइजेशन ( 36 ) द्वारा संचालित छै, लेकिन ई खमीर म॑ मिलै वाला सेरामाइड श्रृंखला केरऽ लंबाई प॑ भी निर्भर करी सकै छै । यद्यपि स्तनधारी जीपीआई-एपी म॑ ईथर लिपिड आधारित एंकर छै, आरू एकरऽ रासायनिक संरचना बहुत लम्बा एसिली चेन सेरामाइड स॑ बहुत अलग छै, लेकिन एगो ताजा अध्ययन म॑ पता चललै कि दोनों लिपिड के विकास के दृष्टि स॑ समान भौतिक आरू रासायनिक गुण छै आरू कार्य ( 40 ) । अतः स्तनधारी कोशिका म॑ ईथर लिपिड भाग खमीर म॑ C26 सेरामाइड के समान होय ​​सकै छै, आरू एकरऽ भूमिका जीपीआई-एपी एकत्रीकरण आरू छँटाई क॑ बढ़ावा दै लेली झिल्ली म॑ लम्बी श्रृंखला वाला सेरामाइड स॑ जुड़ना छै । हालांकि ई संभावना क॑ अखनी तलक सीधा परीक्षण करै के जरूरत छै, लेकिन पिछला निष्कर्ष ई बात के समर्थन करै छै कि गोल्गी शरीर म॑ लम्बा एसिली चेन वाला सेरामाइड केरऽ परिवहन साइटोप्लाज्मिक ट्रांसफर प्रोटीन द्वारा नै करलऽ जाय छै, बल्कि ई खमीर जैसनऽ जीपीआई एंकर के संश्लेषण प॑ निर्भर करै छै । अतः विकासवादी रूढ़िवादी तंत्र एक ही परिवहन पुटिका म॑ बहुत लम्बा एसिल श्रृंखला वाला सेरामाइड आरू जीपीआई-एपी (13, 16, 20, 46, 47) क॑ चुनिंदा रूप स॑ सह-परिवहन करै म॑ सक्षम प्रतीत होय छै ।
खमीर आरू स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका प्रणाली म॑ जीपीआई-एपी केरऽ एकत्रीकरण आरू अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन स॑ अलग होना सब कोशिका केरऽ सतह प॑ पहुँचै स॑ पहल॑ होय छै । पलाडिनो एट अल। (48) न॑ पालै छै कि स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका केरऽ टीजीएन प॑ जीपीआई-एपी क्लस्टरिंग न सिर्फ एपिकल प्लाज्मा झिल्ली म॑ जीपीआई-एपी केरऽ चयनात्मक वर्गीकरण लेली आवश्यक छै, बल्कि जीपीआई-एपी केरऽ क्लस्टरिंग संगठन आरू एकरऽ जैविक गतिविधि क॑ भी नियंत्रित करै छै । कोशिका सतह। खमीर म॑, ई अध्ययन स॑ पता चललै कि ईआर प॑ सी 26 सेरामाइड-निर्भर जीपीआई-एपी समूह प्लाज्मा झिल्ली प॑ जीपीआई-एपी केरऽ समूह संगठन आरू कार्यात्मक गतिविधि क॑ नियंत्रित करी सकै छै ( 24 , 49 ). इस मॉडल के अनुरूप, GhLag1 कोशिका जीपीआई अवरोधक या दवाओं स॑ एलर्जी छै जे कोशिका भित्ति अखंडता (28) क॑ प्रभावित करै छै, आरू खमीर कोशिका के संभोग म॑ प्रक्षेपित टिप सेरामाइड केरऽ कार्यात्मक Gas1-GFP समूह (49) केरऽ आवश्यकता जी hLag1 कोशिका केरऽ संभावित शारीरिक परिणाम क॑ दर्शाबै छै । जीपीआई-एपी त्रुटि। लेकिन, ई आरू परीक्षण करना कि कोशिका केरऽ सतह केरऽ कार्यात्मक संगठन क॑ ईआर स॑ लिपिड केरऽ लंबाई के आधार प॑ छंटाई विधि स॑ प्रोग्राम करलऽ गेलऽ छै कि नै, ई हमरऽ भविष्य केरऽ शोध के विषय होतै ।
अइ कार्य मे उपयोग कैल गेल सैकरोमाइसिस सेरेविसिया उपभेदक कें सूची तालिका S1 मे देल गेल छै. लाइव सेल इमेजिंग के लेल एससीएलआईएम के एमएमवाई1583 आरू एमएमवाई1635 उपभेद के निर्माण डब्ल्यू303 के पृष्ठभूमि म॑ करलऽ गेलऽ छेलै । एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के साथ Sec13-mCherry क॑ व्यक्त करै वाला ई उपभेदऽ क॑ टेम्पलेट के रूप म॑ pFA6a प्लाज्मिड के साथ पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित विधि के उपयोग करी क॑ बनालऽ गेलऽ छेलै (23) । GAL1 प्रोमोटर के नियंत्रण म॑ फ्लोरोसेंट प्रोटीन स॑ लेबल करलऽ गेलऽ Mid2-iRFP क॑ व्यक्त करै वाला तनाव के निर्माण निम्नलिखित तरीका स॑ करलऽ गेलऽ छेलै । pKTiRFP-KAN वेक्टर (ई. ओ'शी, Addgene प्लाज्मिड नंबर 64687 के उपहार; http://n2t.net/addgene: 64687; शोध संसाधन पहचानकर्ता (RRID): Addgene_64687) स॑ iRFP-KanMx अनुक्रम के पीसीआर प्रवर्धन आरू अंतर्जात Mid2 के C-टर्मिनस म॑ डाललऽ गेलऽ छै । Mid2-iRFP जीनोम अनुक्रम क॑ प्रवर्धित करी क॑ GAL1 प्रोमोटर म॑ क्लोन करला के बाद एकरा एकीकरण प्लाज्मिड pRS306 केरऽ Not I-Sac I साइट म॑ एकीकृत करलऽ गेलऽ छेलै । परिणामस्वरूप प्लाज्मिड pRGS7 क॑ Pst I स॑ रेखीय करलऽ गेलऽ छेलै ताकि URA3 लोकस म॑ एकीकृत होय सक॑ ।
Gas1-GFP फ्यूजन जीन सेंट्रोमेर (CEN) प्लाज्मिड म॑ GAL1 प्रोमोटर केरऽ नियंत्रण म॑ व्यक्त करलऽ जाय छै, जेकरऽ निर्माण निम्नलिखित छै । Gas1-GFP अनुक्रम क॑ pRS416-GAS1-GFP प्लाज्मिड (24) (एल. पोपोलो केरऽ उपहार) स॑ पीसीआर द्वारा प्रवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै आरू CEN प्लाज्मिड pBEVY-GL LEU2 (सी केरऽ उपहार) केरऽ Xma I–Xho I साइट म॑ क्लोन करलऽ गेलऽ छेलै । मिलर, आर। एडजीन प्लाज्मिड संख्या 51225; http://n2t.net/addgene: 51225 पर अछि; आरआरआईडी: Addgene_51225)। परिणामस्वरूप प्लाज्मिड के नाम pRGS6 राखल गेल छल । Axl2-GFP फ्यूजन जीन क॑ भी pBEVY-GL LEU2 वेक्टर केरऽ GAL1 प्रोमोटर केरऽ नियंत्रण म॑ व्यक्त करलऽ जाय छै, आरू एकरऽ निर्माण निम्नलिखित छै । Axl2-GFP अनुक्रम क॑ पीसीआर द्वारा pRS304-p2HSE-Axl2-GFP प्लाज्मिड (23) स॑ प्रवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू pBEVY-GL LEU2 वेक्टर केरऽ Bam HI-Pst I साइट म॑ क्लोन करलऽ गेलऽ छेलै । परिणामस्वरूप बनल प्लाज्मिड के नाम pRGS12 राखल गेल। अइ अध्ययन मे उपयोग कैल गेल ओलिगोन्यूक्लिओटाइड कें अनुक्रम तालिका S2 मे सूचीबद्ध छै.
तनाव क॑ 0.2% एडेनिन आरू 2% ग्लूकोज [YP-dextrose (YPD)], 2% रैफिनोज [YP-raffinose] समृद्ध खमीर अर्क प्रोटीन पी (YP) माध्यम (1 % खमीर अर्क आरू 2% प्रोटीन ept) के साथ पूरक करलऽ गेलऽ छेलै । (YPR)] या 2% गैलेक्टोज [YP-गैलेक्टोज (YPG)] कार्बन स्रोत कें रूप मे, या एकटा सिंथेटिक न्यूनतम माध्यम (0.15% खमीर नाइट्रोजन बेस आ 0.5% अमोनियम सल्फेट) मे पोषण कें लेल आवश्यक उचित अमीनो एसिड आ बेस कें पूरक कें लेल , आ 2% ग्लूकोज (सिंथेटिक ग्लूकोज न्यूनतम माध्यम) या 2% गैलेक्टोज युक्त (सिंथेटिक गैलेक्टोज न्यूनतम माध्यम) के कार्बन स्रोत के रूप में |
वास्तविक समय इमेजिंग के लेलऽ, GAL1 प्रोमोटर के तहत निर्माण क॑ व्यक्त करै वाला तापमान-संवेदनशील sec31-1 उत्परिवर्तित कोशिका क॑ YPR माध्यम म॑ 24°C प॑ रात भर मध्य लॉग चरण तलक बढ़ालऽ गेलऽ छेलै । 24 डिग्री सेल्सियस प॑ 1 घंटा तलक वाईपीजी म॑ प्रेरण के बाद, कोशिका क॑ 37 डिग्री सेल्सियस प॑ एसजी म॑ 30 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद स्राव ब्लॉक स॑ रिलीज करै लेली 24 डिग्री सेल्सियस प॑ स्थानांतरित करलऽ गेलऽ छेलै । कोशिका क॑ ग्लास स्लाइड प॑ फिक्स करै लेली कॉन्कनावेलिन ए के प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै आरू एससीएलआईएम द्वारा इमेजिंग करलऽ गेलऽ छेलै । SCLIM ओलंपस IX-71 उल्टा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी आरू UPlanSApo 100×1.4 संख्यात्मक एपर्चर तेल लेंस (ओलंपस), उच्च गति आरू उच्च-सिग्नल-टू-नॉइज अनुपात घूमने वाला डिस्क कॉनफोकल स्कैनर (योकोगावा इलेक्ट्रिक), कस्टम स्पेक्ट्रोमीटर, आरू कस्टम कूलिंग के संयोजन छै The system’s image intensifier (Hamamatsu फोटोनिक्स) ×266.7 के अंतिम आवर्धन वाला आवर्धक लेंस प्रणाली आरू चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा जे इलेक्ट्रॉन क॑ गुणा करै छै (हमामात्सु फोटोनिक्स) (21) प्रदान करी सकै छै । छवि अधिग्रहण कस्टम सॉफ्टवेयर (योकोगावा इलेक्ट्रिक) द्वारा कैल जायत छै. 3D छवि के लेलऽ, हमनें उद्देश्य लेंस क॑ लंबवत रूप स॑ कंपन करै लेली कस्टम-मेड पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर के इस्तेमाल करलकै, आरू ऑप्टिकल भागऽ क॑ 100 एनएम के अंतर प॑ एक ढेर म॑ एकत्रित करलकै । जेड-स्टैक छवि क॑ 3D वोक्सेल डाटा म॑ बदललऽ जाय छै, आरू घूमऽ वाला डिस्क कॉनफोकल माइक्रोस्कोप लेली प्रयोग करलऽ जाय वाला सैद्धांतिक बिंदु फैलाव फंक्शन क॑ वोलोसिटी सॉफ्टवेयर (पर्किनएलमर) द्वारा डिकॉनवोल्यूशन प्रोसेसिंग लेली प्रयोग करलऽ जाय छै । सह-स्थान विश्लेषण कें लेल स्वचालित रूप सं थ्रेशोल्ड करय कें लेल वोलोसिटी सॉफ्टवेयर कें उपयोग करयत, माल सहित ईआरईएस कें मापल गेलय. मेटामोर्फ सॉफ्टवेयर (मोलेकुलर डिवाइसेज) के उपयोग सं लाइन स्कैन विश्लेषण कैल गेल छल.
सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करय कें लेल ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर कें उपयोग करूं. दू-पूंछ वाला स्टूडेंट टी-परीक्षण आरू साधारण एकतरफा विचरण विश्लेषण (एनोवा) परीक्षण के लेलऽ, समूहऽ के बीच अंतर क॑ पी <0.05 (*) प॑ महत्वपूर्ण प्रभाव मानलऽ जाय छै ।
Gas1-GFP केरऽ प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के लेलऽ, लॉग चरण कोशिका क॑ YPD म॑ रात भर बढ़ालऽ गेलऽ छेलै आरू अपकेंद्रित्रण द्वारा एकत्रित करलऽ गेलऽ छेलै, फॉस्फेट बफर खारा स॑ दू बार धोलऽ गेलऽ छेलै, आरू कम स॑ कम 15 मिनट तलक बर्फ प॑ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद सूक्ष्मदर्शी के तहत आगू बढ़लऽ गेलऽ छेलै जैसनऽ कि पहले वर्णित छेलै चेक (24) । अधिग्रहण लेली ऑब्जेक्टिव लेंस, एल 5 (जीएफपी) फिल्टर, हमामात्सु कैमरा आरू एप्लीकेशन सूट एक्स (एलएएस एक्स) सॉफ्टवेयर स॑ लैस लीका डीएमआई8 माइक्रोस्कोप (एचसीएक्स पीएल एपीओ 1003/1.40 ऑयल पीएच3 सीएस) के इस्तेमाल करलऽ गेलऽ छेलै । .
नमूना क॑ 65 डिग्री सेल्सियस प॑ एसडीएस नमूना बफर स॑ 10 मिनट तलक विकृत करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पीएजीई) द्वारा अलग करलऽ गेलऽ छेलै । इम्यूनोब्लॉटिंग विश्लेषण के लेल प्रति लेन 10 μl नमूना लोड कएल गेल छल । प्राथमिक एंटीबॉडी : खरगोश कें पॉलीक्लोनल एंटी-Gas1 कें 1:3000 कें पतलापन पर, खरगोश कें पॉलीक्लोनल एंटी-Emp24 कें 1:500 कें पतलापन पर, आ खरगोश कें पॉलीक्लोनल एंटी-जीएफपी (एच. रिजमैन कें उपहार) कें उपयोग 1:3000 कें पतलापन पर करूं. माउस मोनोक्लोनल एंटी-Pgk1 एंटीबॉडी क॑ 1:5000 (जे. डे ला क्रूज केरऽ उपहार) के पतलापन प॑ प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । द्वितीयक एंटीबॉडी : हॉर्सरैडिश पेरोक्साइडेज (एचआरपी) संयुग्मित बकरी एंटी-खरगोश इम्यूनोग्लोबुलिन जी (IgG) जे 1:3000 (पियर्स) कें पतलापन पर प्रयोग कैल जायत छै. एचआरपी-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी कें उपयोग 1:3000 (पियर्स) कें पतलापन पर कैल गेलय. प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया क्षेत्र क॑ सुपरसिग्नल वेस्ट पिको अभिकर्मक (थर्मो फिशर साइंटिफिक) केरऽ केमिलुमिनेसेंस विधि स॑ देखलऽ गेलऽ छेलै ।
जैसऽ कि (31) म॑ वर्णित छै, समृद्ध ईआर अंश प॑ एक प्राकृतिक इम्यूनोप्रेसिपिटेशन प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । संक्षेप मे, खमीर कोशिका कें TNE बफर [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड आ प्रोटीज अवरोधक मिश्रण) सं 600 nm ( OD600) पर 100 ऑप्टिकल घनत्व पर दू बेर धोउ. एकरा काँच के मोती स तोड़ल गेल, आ फेर कोशिका के मलबा आ कांच के मोती के अपकेंद्रित्रण द्वारा हटा देल गेल। तखन सुपरनेटेंट कें 17,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट तइक अपकेंद्रित्रित कैल गेलय. गोली क॑ टीएनई म॑ पुनः लटका देलऽ गेलै आरू डिजिटलिस सैपोनिन क॑ अंतिम सांद्रता १% तलक मिलालऽ गेलै । निलंबन क॑ 4 डिग्री सेल्सियस प॑ घुमाव के साथ 1 घंटा तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद अघुलनशील घटक क॑ 13,000 ग्राम प॑ 4 डिग्री सेल्सियस प॑ 60 मिनट तलक अपकेंद्रित्रण द्वारा हटाय देलऽ गेलऽ छेलै । Gas1-GFP इम्यूनोप्रेसिपिटेशन कें लेल, पहिले नमूना कें खाली अगरोज बीड्स (ChromoTek) सं 4°C पर 1 घंटा तइक पूर्व-इन्क्यूबेट करूं, आ ओकर बाद GFP-Trap_A (ChromoTek) सं 4°C पर 3 घंटा तइक इन्क्यूबेट करूं. इम्यूनोप्रेसिपिटेड बीड्स क॑ 0.2% डाइगोक्सिजेनिन युक्त टीएनई स॑ पांच बार धोलऽ गेलऽ छेलै, एसडीएस नमूना बफर स॑ इल्यूट करलऽ गेलऽ छेलै, एसडीएस-पीएजीई प॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै, आरू इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै ।
जैसऽ कि (31) म॑ वर्णित छै, समृद्ध ईआर अंश प॑ क्रॉस-लिंकिंग निर्धारण करलऽ गेलऽ छेलै । संक्षेप म॑, समृद्ध ईआर अंश क॑ 0.5 एमएम डाइथियोबिस (सुक्सिनिमिडाइल प्रोपिओनेट) (पियर्स, थर्मो फिशर साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल, अमेरिका; 20 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) स॑ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया क॑ ग्लाइसिन (50 एमएम अंतिम सांद्रता, 5 मिनट, 20 डिग्री सेल्सियस) मिलाबै स॑ बुझाय देलऽ गेलऽ छेलै ।
जैना की पहले वर्णित (50), जंगली प्रकार आरू GhLag1 उपभेदों म॑ सेरामाइड के एमएस विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै । संक्षेप म॑, कोशिका क॑ 30°C प॑ वाईपीडी म॑ घातीय चरण (3 स॑ 4 OD600 यूनिट/एमएल) तलक बढ़ालऽ गेलऽ छेलै, आरू 25×107 कोशिका क॑ कटाई करलऽ गेलऽ छेलै । हुनकऽ चयापचय ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड स॑ बुझाय देलऽ जाय छै । निष्कर्षण विलायक [इथेनॉल, पानी, ईथर, पाइरिडीन आ 4.2 एन अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (15:15:5:1:0.018 v/v)] आ आंतरिक मानक C17 सेरामाइड (860517, अवंटी ध्रुवीय लिपिड) गुणवत्ता कें 1.2 एनएमओएल कें उपयोग करूं. अर्क कें हल्का क्षारीय जलविघटन करय कें लेल मोनोमिथाइलमाइन अभिकर्मक [मेथनॉल, पानी, एन-ब्यूटानॉल आ मिथाइलमाइन घोल (4:3:1:5 v/v)] कें उपयोग करूं, आ ओकर बाद नमक कें हटावय कें लेल पानी सं संतृप्त एन-ब्यूटानॉल कें उपयोग करूं. अंततः, अर्क क॑ सकारात्मक मोड विलायक [क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल/पानी (2:7:1) + 5 एमएम अमोनियम एसीटेट] म॑ पुनः निलंबित करी क॑ मास स्पेक्ट्रोमीटर म॑ इंजेक्ट करलऽ गेलै । स्फिंगोलिपिड अणु के पहचान आरू मात्रा निर्धारण लेली बहु-प्रतिक्रिया निगरानी (एमआरएम) करलऽ गेलऽ छेलै । टीएसक्यू वैंटेज तृतीयक चतुर्ध्रुवीय मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) लिपिड विश्लेषण लेली रोबोटिक नैनोफ्लो आयन स्रोत नैनोमेट एचडी (एडविओन बायोसाइंसेज, इथाका, एनवाई) स॑ लैस छै । टक्कर ऊर्जा प्रत्येक सेरामाइड श्रेणी के लेल अनुकूलित छै. एमएस डाटा पॉजिटिव मोड मे प्राप्त कैल गेल। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लेलऽ लिपिड संकेत तीन स्वतंत्र मापनऽ के माध्यिका होय छै ।
जैसऽ कि (31) म॑ वर्णित छै, Gas1-GFP क॑ व्यक्त करै वाला कोशिका (800×107) क॑ प्राकृतिक इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के अधीन करलऽ गेलऽ छेलै । शुद्ध Gas1-GFP क॑ SDS-PAGE द्वारा अलग करी क॑ पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली म॑ स्थानांतरित करलऽ गेलऽ छेलै । प्रोटीन क॑ पीवीडीएफ क॑ एमाइड ब्लैक स॑ रंगी क॑ विजुअलाइज करलऽ गेलऽ छेलै । Gas1-GFP बैंड क॑ पीवीडीएफ स॑ काट क॑ 5 बार मेथनॉल आरू एक बार लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-एमएस (एलसी-एमएस) ग्रेड पानी स॑ धोलऽ गेलऽ छेलै । झिल्ली पट्टी क॑ 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), बफर आरू 500μl ताजा घुललऽ 1 M सोडियम नाइट्राइट मिश्रण स॑ 37°C प॑ 3 घंटा तलक इन्क्यूबेशन करी क॑ लिपिड अंश क॑ Gas1-GFP स॑ रिलीज करलऽ जाय छै आरू ग्लूकोसामाइन आरू इनोसिटोल (51) के बीच इनोसाइने फॉस्फेट सेरामाइड केरऽ रिलीज होय क॑ लाइज करलऽ जाय छै । एकरऽ बाद झिल्ली पट्टी क॑ एलसी-एमएस ग्रेड केरऽ पानी स॑ चारि बार धोलऽ गेलै, कमरा केरऽ तापमान प॑ सुखायलऽ गेलै, आरू विश्लेषण तलक नाइट्रोजन वातावरण म॑ -८० डिग्री सेल्सियस प॑ संग्रहित करलऽ गेलै । नियंत्रण के रूप म॑ हर प्रयोग लेली पीवीडीएफ झिल्ली केरऽ खाली नमूना के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै । Gas1-GFP स॑ निकाललऽ गेलऽ लिपिड क॑ तखन॑ एमएस द्वारा विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै जैसनऽ कि वर्णित छै (50) । संक्षेप म॑, जीपीआई-लिपिड युक्त पीवीडीएफ पट्टी क॑ 75μl नकारात्मक मोल्ड विलायक [क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल (1:2) + 5 एमएम अमोनियम एसीटेट] म॑ पुनः निलंबित करलऽ गेलऽ छेलै आरू स्फिंगोलिपिड प्रजाति केरऽ इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई)-एमआरएम/एमएस विश्लेषण (टीएसक्यू वैंटेज) पारित करलऽ गेलऽ छेलै । एहि मामला मे एमएस डाटा नेगेटिव आयन मोड मे प्राप्त कैल गेल छल ।
जैना कि पहले कहलऽ गेलऽ छै, जीपीआई एंकर केरऽ लिपिड भाग क॑ [3H]-इनोसिटोल-लेबल जीपीआई-एपी (16) स॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै । लिपिड क॑ विलायक प्रणाली (55:45:10 क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-0.25% केसीएल) के उपयोग करी क॑ पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग करलऽ गेलऽ छेलै आरू एफएलए-7000 (फुजीफिल्म) के उपयोग स॑ विजुअलाइज करलऽ गेलऽ छेलै ।
Gas1-GFP (600×107) क॑ व्यक्त करै वाला कोशिका क॑ TNE बफर स॑ TNE बफर स॑ दू बार धोलऽ गेलऽ छेलै, आरू ग्लास बीड्स स॑ तोड़लऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद सेल मलबा आरू ग्लास बीड्स क॑ हटाबै लेली अपकेंद्रित्रित करलऽ गेलऽ छेलै । तखन सुपरनेटेंट कें 17,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटा तइक अपकेंद्रित्रित कैल गेलय. गोली क॑ टीएनई म॑ धोलऽ गेलऽ छेलै आरू 0.2% डिजिटलिस सैपोनिन वाला टीएनई म॑ 1 यू पीआई-पीएलसी (इन्विट्रोजन) स॑ 37 डिग्री सेल्सियस प॑ 1 घंटा तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । एंजाइम उपचार के बाद झिल्ली क॑ 17,000 ग्राम प॑ 4 डिग्री सेल्सियस प॑ 1 घंटा तलक अपकेंद्रित्रण द्वारा हटाय देलऽ गेलै । Gas1-GFP क॑ इम्यूनोप्रेसिपिटेट करै लेली, सुपरनेटेंट क॑ GFP-Trap_A (ChromoTek) स॑ 4°C प॑ रात भर इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । SDS-PAGE द्वारा अलग करलऽ गेलऽ शुद्ध Gas1-GFP क॑ Coomassie ब्रिलियंट ब्लू स॑ रंगलऽ गेलऽ छेलै । Gas1-GFP धुंधलापन बैंड क॑ एक्वाडक्ट के आसपास के ग्रे स॑ काटलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद आयोडोएसिटामाइड स॑ अल्काइलेशन आरू डाइथियोथ्राइटोल स॑ रिडक्शन के बाद ट्रिप्सिन के साथ इन-जेल पाचन करलऽ गेलऽ छेलै । जीपीआई-ग्लाइकन के साथ ट्रिप्टिक पेप्टाइड एवं पेप्टाइड निकालना एवं सुखा | सूखे पेप्टाइड क॑ 20 μl पानी म॑ घोललऽ गेलऽ छेलै । एलसी मे एक भाग (8μl) इंजेक्ट करू। विशिष्ट ढाल परिस्थिति म॑ पेप्टाइड क॑ अलग करै लेली एक ऑक्टाडेसिलसिलेन (ODS) कॉलम (Develosil 300ODS-HG-5; भीतरी व्यास 150 मिमी×1.0 मिमी; नोमुरा केमिकल, ऐची प्रान्त, जापान) के प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । मोबाइल चरण विलायक ए (0.08% फॉर्मिक एसिड) आ विलायक बी (80% एसीटोनिट्राइल मे 0.15% फॉर्मिक एसिड) छै. एक एक्सेला एचपीएलसी प्रणाली (थर्मो फिशर साइंटिफिक, बोस्टन, मैसाचुसेट्स) के उपयोग करी क॑ 55 मिनट के भीतर 55 मिनट के भीतर 50 μl min-1 के प्रवाह दर स॑ 5 मिनट तलक विलायक ए स॑ स्तंभ क॑ इल्यूट करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद विलायक बी के सांद्रता बढ़ा क॑ 40% करी देलऽ गेलऽ छेलै । , संयुक्त राज्य अमेरिका)। इल्यूएट क॑ ईएसआई आयन स्रोत म॑ लगातार पेश करलऽ गेलऽ छेलै, आरू जीपीआई-ग्लाइकन वाला ट्रिप्टिक पेप्टाइड आरू पेप्टाइड क॑ एलटीक्यू ऑर्बिट्रैप एक्सएल (हाइब्रिड रैखिक आयन ट्रैप-ऑर्बिट्राप मास स्पेक्ट्रोमीटर; थर्मो फिशर साइंटिफिक) द्वारा विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै । एमएस सेटअप म॑ केशिका स्रोत केरऽ वोल्टेज ४.५ केवी प॑ सेट करलऽ गेलऽ छेलै, आरू स्थानांतरण केशिका केरऽ तापमान ३०० डिग्री सेल्सियस प॑ रखलऽ गेलऽ छेलै । केशिका वोल्टेज आ ट्यूब लेंस वोल्टेज क्रमशः 15 वी आ 50 वी पर सेट कएल गेल छल । एमएस डाटा 300/m/z द्रव्यमान/चार्ज अनुपात (m/z) 3000 के द्रव्यमान सीमा म॑ पॉजिटिव आयन मोड (60,000 के रिजोल्यूशन; 10 भाग प्रति मिलियन के द्रव्यमान सटीकता) म॑ प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै ।एमएस/एमएस डाटा एलटीक्यू ऑर्बिट्रैप एक्सएल म॑ आयन ट्रैप के माध्यम स॑ प्राप्त करलऽ गेलऽ छै [पहिलऽ 3 अंक जेकरा प॑ डाटा निर्भर करै छै, टक्कर स॑ विच्छेदन पैदा होय छै (सीआईडी)]।
एमडी सिमुलेशन ग्रोमैक्स (52) सॉफ्टवेयर आरू मार्टिनी 2 फोर्स फील्ड (53-55) के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै । तखन CHARMM GUI झिल्ली बिल्डर (56, 57) के उपयोग डायओलियोइलफॉस्फेटिडाइलकोलाइन (DOPC) आरू Cer C18 या DOPC आरू Cer C26 वाला द्विपरत के निर्माण लेली करलऽ गेलऽ छेलै । Cer C26 केरऽ टोपोलॉजी आरू निर्देशांक स्फिंगोसिन पूंछ स॑ अतिरिक्त बीड्स क॑ हटाय क॑ DXCE स॑ प्राप्त करलऽ जाय छै । डबल लेयर कें संतुलित करय आ ओकरा चलावा कें लेल निम्नलिखित वर्णित प्रक्रिया कें उपयोग करूं, तखन Emp24 युक्त सिस्टम कें निर्माण कें लेल सिस्टम कें अंतिम निर्देशांक कें उपयोग करूं. खमीर Emp24 (अवशेष 173 स॑ 193) केरऽ ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन क॑ दृश्य एमडी (वीएमडी) उपकरण आणविक संरचना (58) के उपयोग करी क॑ एक α-हेलिक्स के रूप म॑ बनालऽ गेलऽ छेलै । तखन ओवरलैपिंग लिपिड क॑ हटाबै के बाद प्रोटीन क॑ मोटऽ दानेदार बना क॑ CHARMM GUI के उपयोग करी क॑ द्विपरत म॑ डाललऽ गेलै । अंतिम प्रणाली मे 1202 डीओपीसी आ 302 सेर सी26 या 1197 डीओपीसी आ 295 सेर सी18 आ Emp24 शामिल अछि । सिस्टम कें 0.150M कें सांद्रता मे आयनित करूं. दू द्विपरत रचना के लेल चारि स्वतंत्र प्रतिकृति बनाओल गेल ।
लिपिड द्विपरत क॑ CHARMM GUI प्रक्रिया के उपयोग करी क॑ संतुलित करलऽ जाय छै, जेकरा म॑ 405,000 चरणऽ क॑ न्यूनतम करलऽ जाय छै आरू ओकरा बाद संतुलन बनाबै के काम करलऽ जाय छै, जहाँ स्थिति के बाधा क॑ धीरे-धीरे कम करी क॑ समाप्त करी देलऽ जाय छै, आरू समय केरऽ चरण क॑ 0.005 पीएस स॑ बढ़ा क॑ 0.02 पीएस करी देलऽ जाय छै । संतुलन के बाद ई 0.02 पीएस के समय चरण के साथ 6 μs पैदा करै छै । Emp24 डालय कें बाद, सिस्टम कें न्यूनतम आ संतुलित करय कें लेल वही CHARMM GUI प्रक्रिया कें उपयोग करूं, आ ओकर बाद उत्पादन मे 8 s कें लेल चलूं.
सब प्रणाली के लेलऽ संतुलन प्रक्रिया के दौरान दबाव क॑ बेरेंडसन बैरोस्टेट (59) द्वारा नियंत्रित करलऽ जाय छै, आरू उत्पादन प्रक्रिया के दौरान दबाव क॑ पारिनेलो-रहमान बैरोस्टेट (60) द्वारा नियंत्रित करलऽ जाय छै । सब मामला म॑ औसत दबाव १ बार होय छै आरू अर्ध-समरूप दबाव युग्मन योजना के प्रयोग करलऽ जाय छै । संतुलन आरू उत्पादन प्रक्रिया म॑ गति पुनः मापन वाला थर्मोस्टेट (61) के उपयोग क्रमशः प्रोटीन, लिपिड आरू विलायक कणऽ के तापमान क॑ युग्मित करै लेली करलऽ जाय छै । पूरा ऑपरेशन के दौरान लक्ष्य तापमान 310K अछि. गैर-बंधन अंतःक्रिया कें गणना 0.005 बफर सहिष्णुता कें साथ वर्लेट योजना कें उपयोग करयत एकटा जोड़ीदार सूची उत्पन्न करयत कैल जायत छै. कूलम्ब पद के गणना प्रतिक्रिया क्षेत्र आरू 1.1 एनएम के कट-ऑफ दूरी के उपयोग करी क॑ करलऽ जाय छै । वैंडर वाल्स पद म॑ १.१ एनएम केरऽ कट-ऑफ दूरी वाला कट-ऑफ योजना के प्रयोग करलऽ जाय छै, आरू वर्लेट कट-ऑफ योजना के प्रयोग संभावित बहाव (62) लेली करलऽ जाय छै ।
वीएमडी के उपयोग करी क॑ डीओपीसी फॉस्फेट बीड्स या सेरामाइड एएम१ बीड्स आरू प्रोटीन के बीच कटऑफ तरंग दैर्ध्य ०.७ एनएम होय छै, आरू प्रोटीन के साथ बातचीत करै वाला लिपिड के संख्या के गणना करलऽ जाय छै । निम्नलिखित सूत्र के अनुसार, (63) के अनुसार क्षय-संवर्धन (DE) कारक की गणना कीजिए: DE कारक = (प्रोटीन में कुल लिपिड की मात्रा 0.7) प्रोटीन 0.7 (कुल लिपिड में Cer की मात्रा) में
रिपोर्ट कैल गेल मान औसतन कें रूप मे प्राप्त कैल जैत छै, आ त्रुटि बार एसई कें चारि स्वतंत्र प्रतियक छै. डीई कारक के सांख्यिकीय महत्व की गणना टी परीक्षण [(औसतडीई-कारक-1)/एसई] द्वारा की जाती है | एक पूंछ वितरण से पी मान की गणना कीजिए |
ग्रोमैक्स टूल के उपयोग ट्रेस के अंतिम 250 ns के भीतर Emp24 युक्त सिस्टम के 2D पार्श्व घनत्व मानचित्र के गणना करै लेली करलौ गेलौ छेलै । सेरामाइड केरऽ संवर्धन/क्षय नक्शा प्राप्त करै लेली Cer केरऽ घनत्व मानचित्र क॑ Cer आरू DOPC केरऽ नक्शा के योग स॑ विभाजित करलऽ जाय छै, आरू ओकरा बाद शरीर म॑ Cer केरऽ सांद्रता स॑ विभाजित करलऽ जाय छै । ओही रंग नक्शा पैमाना के प्रयोग कयल जाइत अछि।
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सोफिया रोड्रिग्ज-गैलार्डो, काजुओ कुरोकावा, सुसाना सबिडो-बोजो, अलेक्जेंडर कोर्टेज · गोमेज (अलेक्जेंडर कोर्टेस-गोमेज), अत्सुको इकेदा (अत्सुको इकेडा), वैलेरिया ज़ोनी (वैलेरिया ज़ोनी), ऑक्सीलियाडोरा एगुइलेरा-रोमेरो, एना मारिया पेरेज -लिनेरो), सर्जियो लोपेज (सर्जियो लोपेज), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकीरा, स्टीफनो फैनी, अकिहिको नकानो, मैनुअल मुनिज
3D उच्च रिजोल्यूशन रियल-टाइम इमेजिंग चयनात्मक आउटपुट साइट म॑ प्रोटीन छँटाई लेली सेरामाइड चेन लंबाई के महत्व के खुलासा करै छै ।
सोफिया रोड्रिग्ज-गैलार्डो, काजुओ कुरोकावा, सुसाना सबिडो-बोजो, अलेक्जेंडर कोर्टेज · गोमेज (अलेक्जेंडर कोर्टेस-गोमेज), अत्सुको इकेदा (अत्सुको इकेडा), वैलेरिया ज़ोनी (वैलेरिया ज़ोनी), ऑक्सीलियाडोरा एगुइलेरा-रोमेरो, एना मारिया पेरेज -लिनेरो), सर्जियो लोपेज (सर्जियो लोपेज), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकीरा, स्टीफनो फैनी, अकिहिको नकानो, मैनुअल मुनिज
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