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रीढ़ के हड्डी वाला जीवऽ के विपरीत, कीड़ा-मकोड़ाऽ म॑ व्यापक रूप स॑ नर-पक्षपाती सेक्स स्टेरॉयड हार्मोन के कमी मानलऽ जाय छै ।एनोफिलीज गैम्बिया म॑ एकडाइसोन स्टेरॉयड 20-हाइड्रोक्सीएकडाइसोन (20E) के विकास मादा द्वारा संश्लेषित होय के समय अंडा के विकास क॑ नियंत्रित करै लेली आरू नर द्वारा यौन स्थानांतरण करला प॑ संभोग प्रतिरोधक अवधि क॑ प्रेरित करै लेली प्रतीत होय छै3.अंडा के विकास स॑ आ संभोग आवश्यक प्रजनन लक्षण छै, इ समझनाय की मादा एनोफिलीज मच्छर इ हार्मोनल संकेतक कें कोना एकीकृत करय छै, नव मलेरिया नियंत्रण कार्यक्रमक कें डिजाइन कें सुविधा प्रदान कयर सकय छै.एतय, हम खुलासा करय छै की इ प्रजनन कार्यक कें एकडिस्टेरॉइड-सक्रिय/निष्क्रिय करय वाला एंजाइम कें एकटा जटिल नेटवर्क कें माध्यम सं अलग-अलग सेक्स स्टेरॉयड द्वारा नियंत्रित कैल जायत छै.हम एकटा नर-विशिष्ट ऑक्सीकरण एकडीसोन, 3-डिहाइड्रो-20E (3D20E), जे यौन स्थानांतरण आ डिफॉस्फोरिलेशन द्वारा सक्रियण कें बाद महिला यौन ग्रहणशीलता कें बंद कयर माता-पिता कें सुरक्षा करएयत छै.उल्लेखनीय रूप सं, 3D20E स्थानांतरण प्रजनन जीन कें अभिव्यक्ति कें सेहो प्रेरित करएयत छै जे प्लाज्मोडियम संक्रमण कें दौरान अंडा कें विकास कें बनाए रखएयत छै, सं संक्रमित महिलाक कें स्वास्थ्य सुनिश्चित करएयत छै.महिला सं उत्पन्न 20E यौन उत्प्रेरक नहि पैदा करएयत छै प्रतिक्रिया, लेकिन 20E-निरोधक किनेज़ कें रोकल गेलाक कें बाद संभोग व्यक्तियक कें अंडा देवय कें अनुमति देयत छै.ई नर-विशिष्ट कीट स्टेरॉयड हार्मोन कें पहचान आ महिला यौन ग्रहणशीलता, प्रजनन क्षमता आ प्लाज्मोडियम कें साथ बातचीत कें नियंत्रित करय मे एकर भूमिका मलेरिया संचरण करय वाला मच्छरक कें प्रजनन सफलता कें कम करय कें संभावना कें सुझाव देयत छै.
मलेरिया कें मामला आ मौतक मे फेर सं वृद्धि भ रहल छै4 मानव मलेरिया परजीवी कें एकमात्र संवाहक एनोफिलिस मच्छर मे व्यापक कीटनाशक प्रतिरोधक क्षमता कें कारण.अइ मच्छरक कें संभोग जीव विज्ञान नवीन मलेरिया नियंत्रण हस्तक्षेपक कें लेल विशेष रूप सं आकर्षक लक्ष्य छै, कियाकि मादा केवल एक बेर संभोग करएयत छै5; एहि एकल संभोग घटना कें बाँझ बनावा सं खेत मे मच्छरक कें आबादी कें कम करय कें बहुत संभावना होयत.
पुरुषक सं उच्च टीटर स्टेरॉयड हार्मोन प्राप्त करला के बाद महिला यौन अक्षम भ जायत छै.अध्ययन सं पता चलल छै कि आगू संभोग मे दिक्कत कें ट्रिगर 20-हाइड्रोक्सीएक्डाइसोन (20E) छै, जे एकटा स्टेरॉयड हार्मोन छै जे लार्वा अवस्था मे मोल्टिंग चक्र कें नियामक कें रूप मे बेसि जानल जायत छै.नर कें 20E कें संश्लेषण आ स्थानांतरण करय कें क्षमता विशेष रूप सं 20E मे विकसित भेल छै एनोफिलीज प्रजाति जे उपजीनस सेलिया7 कें हिस्सा छै, जे अफ्रीका मे वितरित छै आ मलेरिया कें सब सं खतरनाक संवाहक शामिल छै, जेकरा मे एनोफिलीज गैम्बिया शामिल छै.ई विशेष रूप सं उल्लेखनीय छै, कियाकि इ प्रजातियक मे मादा प्रत्येक रक्त भोजन कें बाद 20E सेहो पैदा करएयत छै, आ 20E ओजेनेसिस चक्र कें संचालित करएयत छै (देखूं संदर्भ 8).हालांकि, मादा कें एकीकरण कें तरीका कें बारे मे बहुत कम जानकारी छै एकडाइसोन कें दू अलग-अलग स्रोत (पुरुष स्थानांतरण आ रक्त खिला कें प्रेरण) सं संकेतक कें बिना अपन संभोग कें क्षमता सं समझौता करएय कें.वास्तव मे, यदि मादाक कें द्वारा उत्पादित 20E यौन असहिष्णुता कें ट्रिगर करएयत छै, त इ कुंवारी भोजन करएय वाला व्यक्तियक मे बांझपन कें कारण बनतय, जे अइ मच्छरक मे एकटा बहुत आम व्यवहार छै5.
एकरऽ संभावित व्याख्या ई छै कि ए.गैम्बिया नर एक संशोधित नर-विशिष्ट एकडाइसोन क॑ स्थानांतरित करी दै छै, जे महिला प्रजनन पथ म॑ एक संकेत झरना क॑ सक्रिय करै छै, जेकरऽ परिणामस्वरूप संभोग अस्थिरता पैदा होय छै ।हालांकि, यद्यपि रीढ़ के हड्डी वाला जीवऽ म॑ कई स्टेरॉयड हार्मोन होय ​​छै, जेना कि एस्ट्रोजन आरू एंड्रोजन (संदर्भ 9 म॑ समीक्षा करलऽ गेलऽ छै), हमरऽ जानकारी के अनुसार, एंड्रोजेनिक-पक्षपातपूर्ण स्टेरॉयड के पहचान म॑ नै करलऽ गेलऽ छै कीड़ा-मकोड़ा।
हम संभावित संशोधन स्टेरॉयड के खोज में यौन रूप सं परिपक्व ए.गैम्बिया के पुरुष पुरुष सहायक ग्रंथि (MAG) में स्टेरॉयड हार्मोन के रेपर्टरी निर्धारित करय लेल निकललहुं.पहिने प्रयोग कयल गेल कम विशिष्ट विधि के बजाय टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HPLC-MS/MS) के साथ युग्मित उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी के उपयोग करैत, हम एहि ऊतक में एकडिसोन (E) आ 20E के पता लगेलहुं, जे पहिने के पुष्टि केलक result.हालांकि, नमूना म॑ ऑक्सीकरण फॉस्फोरिलेशन स्टेरॉयड केरऽ बोलबाला छेलै, जे सूत्र 3-डीहाइड्रो-20E22P)12 (चित्र 1) के अनुरूप छेलै ।अन्य रूपऽ म॑ 3-डीहाइड्रो-20E (3D20E) आरू 20E-22-फॉस्फेट (20E22P) शामिल छै 3D20E22P अपनऽ डिफॉस्फोरिलेशन रूप, 3D20E स॑ दू आर्डर के परिमाण अधिक छेलै आरू ई आरू 20E (चित्र 1) स॑ तीन ऑर्डर अधिक छेलै ।हालांकि शरीर केरऽ अन्य भाग आरू निचला प्रजनन मार्ग (एलआरटी; विस्तारित डाटा चित्र 1a) म॑ भी ।हम॑ नयका बंद (<1 दिन पुरानऽ) नर आरू महिला आ केवल एमएजी मे 3D20E आ 3D20E22P कें पता चलल; ई, 20ई आरू 20ई22पी दूनू लिंग म॑ मौजूद छेलै (विस्तारित आंकड़ा चित्र 1b).ई आंकड़ा बताबै छै कि ए.गैम्बिया वयस्क नर अपनऽ एमएजी म॑ संशोधन हार्मोन केरऽ उच्च टीटर पैदा करै छै जे मादा द्वारा संश्लेषित नै होय छै ।
एमएजी आ महिला एलआरटी (अलिंद, वीर्य पुटिका, आ पैरोवेरियम सहित) कें 4 दिन कें (4 दिन कें) कुमारी नर आ कुंवारी आ संभोग कैल गेल मादा (0.5, 3, आ 12 एचपीएम) सं विच्छेदित कैल गेलय.ई ऊतकक मे एकडाइसोन कें एचपीएलसी-एमएस/एमएस (औसत ± सेम; अयुग्मित टी-टेस्ट, दू-पक्षीय, दू-पक्षीय,) द्वारा विश्लेषण कैल गेलय. झूठी खोज दर (एफडीआर) सही कएल गेल; 3 घंटा बनाम 0.5 घंटा, पी = 0.25;12 घंटा बनाम 3 घंटा, पी = 0.0032;12 घंटा बनाम 0.5 घंटा, पी = 0.015).डेटा तीन जैविक प्रतिकृति सं छै.ब्याज कें प्रत्येक ecdysone कें लेल पीक क्षेत्र कें गणना कैल गेलय आ मच्छर कें संख्या सं सामान्य कैल गेलय.Ecdysone कें रंग सं निम्नलिखित रूप सं दर्शाओल गेल छै: ई, हरियर; 20ई, नारंगी रंग के; 20E22P, बैंगनी रंग के; 3D20E, नीला रंगक; 3D20E22P, गुलाबी.इनसेट वाई-अक्ष पर पैमाना बढ़ाबै छै ताकि कम एकडाइसोन स्तर दिखाय सकय.
ई जांच करै लेली कि संभोग के दौरान 3D20E22P आरू 3D20E के स्थानांतरण होय छै कि नै, हमन॑ संभोग के बाद विभिन्न समय बिंदु प॑ मादा एलआरटी के विच्छेदन करलकै ।हालांकि कुमारी म॑ एकडाइसोन नै मिललै, लेकिन हमन॑ संभोग के तुरंत बाद एलआरटी म॑ 3D20E22P के पर्याप्त मात्रा (0.5 घंटा संभोग के बाद, एचपीएम) देखलऽ गेलै, जे समय के साथ घटत॑ गेलै, जबकि 3D20E केरऽ स्तर म॑ काफी वृद्धि होय गेलै (चित्र 1).रासायनिक रूप स॑ संश्लेषित 3D20E क॑ मानक के रूप म॑ प्रयोग करी क॑ हमन॑ ई निर्धारित करलकै कि संभोग एलआरटी म॑ ई स्टेरॉयड हार्मोन केरऽ स्तर 20E (विस्तारित डाटा तालिका 1) स॑ कम स॑ कम 100 गुना अधिक छेलै ।इस तरह, 3D20E22P प्रमुख पुरुष एकडिसोन छै जे संभोग के दौरान मादा एलआरटी म॑ स्थानांतरित होय जाय छै, आरू एकरऽ डिफॉस्फोरिलेशन रूप, 3D20E, संभोग के कुछ समय बाद ही बहुत प्रचुर मात्रा म॑ होय जाय छै ।ई स॑ पता चलै छै कि महिला संभोग के बाद के जीव विज्ञान म॑ बाद वाला एकडाइसोन लेली एगो महत्वपूर्ण भूमिका छै ।
एक नया आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) डाटासेट (चित्र 2a) उत्पन्न करला के बाद, एक कस्टम-निर्मित बायोइन्फोर्मैटिक्स पाइपलाइन के उपयोग करला के बाद, हमनें ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), आरू ecdysone एन्कोडिंग 20E-संशोधित फॉस्फेटेज जीन.EPP) प्रजनन ऊतकों म॑ व्यक्त करलऽ जाय छै.हम॑ एक उम्मीदवार ईपीपी जीन आरू दू के पहचान करलकै संभावित EcK जीन (EcK1 आरू EcK2), लेकिन एक अच्छा उम्मीदवार ईओ जीन.उल्लेखनीय रूप स॑, व्यक्तिगत ईपीपी जीन गैम्बियाई एमएजी म॑ उच्च स्तर (98.9 वीं परसेंटाइल) प॑ व्यक्त करलऽ गेलऽ छेलै लेकिन महिला एलआरटी (चित्र 2b) म॑ नै, जे हमरऽ अपेक्षा के विपरीत छेलै, कैन्हेंकि 3D20E22P केरऽ डिफॉस्फोरिलेशन ई महिला ऊतक म॑ घटित होय गेलऽ छेलै कि नर ईपीपी संभोग के दौरान स्थानांतरित करलऽ जाब॑ सकै छै.वास्तव म॑, हमन॑ संभोग के बाद महिला प्रोटीन क॑ मास्क करै लेली इन विवो स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के प्रयोग करलकै, जे महिला अलिंद म॑ एमएस द्वारा पहचानलऽ गेलऽ एगो एंजाइम छै (चित्र 2c आरू पूरक तालिका 1).एमएजी आरू संभोग (लेकिन कुमारी नै) मादा एलआरटी म॑ ईपीपी केरऽ उपस्थिति के भी विशिष्ट एंटीबॉडी (चित्र 2d) के उपयोग करी क॑ पुष्टि करलऽ गेलऽ छेलै ।
क, प्रत्येक लिंग कें प्रजनन ऊतकक मे EcKs, EOs, आ EPPs कें एन्कोडिंग करय वाला जीन कें खोज करय कें लेल एकटा कस्टम-निर्मित जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन.तीर कें बगल मे संख्या प्रत्येक चरण मे पुरु ष आ महिला उम्मीदवारक कें संख्या कें संकेत करय छै.ई विश्लेषण मे एकटा ईपीपी जीन (ईपीपी) आ एकटा ईसीके जीन (EcK1) कें पहचान कैल गेलय जे नर मे व्यक्त कैल जायत छै, आ एकटा ईसीके जीन (EcK2) जे दूनू लिंग मे अभिव्यक्त होयत छै मुदा एकटा उम्मीदवार ईओ जीन नहि दैत छै.b, वर्जिन (V) आ संभोग (M) एनोफिलीज गैम्बिया आ एनोफिलीज अल्बिकनस ऊतक मे उम्मीदवार जीन अभिव्यक्ति कें तुलना करय वाला हीटमैप.Spca, निषेचन; पुरुष मे मैग, सहायक ग्रंथि; शरीर केरऽ अन्य भाग, जेकरा म॑ स्तन, पंख, पैर, मोटऽ शरीर, आरू दोनों लिंगऽ म॑ आंतरिक अंग, आरू महिला म॑ अंडाशय शामिल छै.EcK2 गैम्बिया केरऽ एमएजी आरू अलिंद दूनू म॑ अधिक अभिव्यक्त होय छै, जबकि ईपीपी केवल MAG.c म॑ पाबै जाय छै, पुरुष स्खलन समूह केरऽ स्थानांतरण केरऽ प्रोटीओमिक विश्लेषण म॑ महिला अलिंद म॑ 3, 12 आरू 24 घंटा, 67 सब सं प्रचुर मात्रा मे प्रोटीन कें दर्शा रहल छै.मादाक कें सब प्रोटीन कें लेबल (आ मास्क) करय कें लेल 15N युक्त आहार पर पालन कैल गेलय.अनटैग नर कें टैग कैल गेल मादाक कें साथ संभोग कैल गेलय, आ प्रोटीओमिक विश्लेषण कें लेल महिला एलआरटी कें 3, 12 आ 24 एचपीएम पर विच्छेदन कैल गेलय (स्खलन प्रोटीन कें पूरा सूची कें लेल पूरक तालिका 1 देखूं).इनसेट, ईपीपी, Eck1 आ EcK2 कें पता कुंवारी नर कें एमएजी मे इ ऊतकक कें प्रोटीओमिक विश्लेषण सं लगायल गेलय.d, संभोग करय वाला मादा कें एमएजी आ एलआरटी मे वेस्टर्न ब्लॉट सं ईपीपी कें पता चलल गेलय, मुदा कुंवारी मादा या नर या बाकी महिला शरीर मे नहि.झिल्ली कें एक साथ एंटी-एक्टिन (लोडिंग कंट्रोल) आ एंटी-ईपीपी एंटीबॉडी सं जांच कैल गेलय.सब नर कुमारी छै.See जेल स्रोत डेटा कें लेल पूरक चित्र 1.वेस्टर्न ब्लॉट दू बेर समान परिणामक कें साथ कैल गेलय.
ईपीपी केरऽ ecdysteroid फॉस्फोफॉस्फेटेज गतिविधि क॑ एचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा एमएजी (विस्तारित डाटा चित्र 2a) स॑ अलग करलऽ गेलऽ 3D20E22P के साथ ऊष्मायन के बाद सत्यापित करलऽ गेलऽ छेलै ।एकरऽ अलावा, जब॑ हमन॑ आरएनए-मध्यस्थता वाला हस्तक्षेप (आरएनएआई) द्वारा ईपीपी क॑ चुप करलऽ गेलऽ छेलै, त॑ हमन॑ ई नर (चित्र 3a), आरू मादा केरऽ प्रजनन ऊतकऽ म॑ फॉस्फेटेज गतिविधि म॑ मजबूत कमी के पता चललै ईपीपी-मौन नर के साथ संभोग करलऽ गेलऽ महत्वपूर्ण आंशिक जीन मौन (विस्तारित आंकड़ा चित्र 2b,c) के बावजूद डिफॉस्फोरिलेशन 3D20E (चित्र 3b) के एक कम अनुपात दिखाय देलऽ गेलऽ छेलै ।एकरऽ विपरीत, हमन॑ वही मच्छरऽ म॑ 20E22P/20E अनुपात म॑ महत्वपूर्ण परिवर्तन के पता नै चललै, जेकरा स॑ पता चल॑ सकै छै कि एंजाइम 3D20E22P (चित्र 3b) के लेलऽ विशिष्ट छै । 3ख)।
क, डबल-स्ट्रैंड ईपीपी आरएनए (dsEPP) या डबल-स्ट्रैंड जीएफपी आरएनए (dsGFP) नियंत्रण कें उपयोग सं ईपीपी साइलेंसिंग कें कारण एमएजी मे फॉस्फेटेज गतिविधि मे कमी.प्रत्येक प्रतिकृति (पी = 0.0046, जोड़ीदार टी-परीक्षण, दू-तरफा) मे बीस एमएजी पूल कें उपयोग करल गेलय छेलै, जेकरा अलग-अलग डॉट्स.b.b, ईपीपी-साइलेंड नर कें साथ संभोग करल गेलय मादाक कें एक 3 एचपीएम (पी = 0.0043, अयुग्मित टी-परीक्षण, दो-तरफा) पर डिफॉस्फोरिलेशन 3D20E केरऽ काफी कम अनुपात, जबकि 20E स्तर अप्रभावित (पी = 0.063, अयुग्मित) छेलै । टी-परीक्षण, दू-तरफा).आँकड़ा 13, 16 आ 19 मादा प्रत्येक कें तीन पूल सं औसत ± सेम कें रूप मे प्रस्तुत कैल गेल छै.c, ईपीपी-चुप कराएल गेल नर सं संभोग करय वाला मादा मे पुनः संभोग कें दर काफी बेसि छल (पी = 0.0002, फिशर कें सटीक परीक्षण, दू-तरफा).मादाक कें पहिले ओकर संभोग कें स्थिति सुनिश्चित करय कें लेल संभोग करय कें लेल मजबूर कैल गेलय; 2 दिन बाद, ओकरा ट्रांसजेनिक शुक्राणु कें वाहक अन्य नर सं संपर्क कैल गेलय ताकि ट्रांसजीन कें मात्रात्मक पीसीआर पता लगावय सं पुनः संभोग दर कें आकलन कैल जा सकय.d, ईपीपी-चुप कराएल गेल नर सं संभोग कैल गेल रक्त-खिलाएल मादा मे प्रजनन क्षमता मे काफी कमी आयल छल (पी < 0.0001; मान-व्हिटनी परीक्षण, दू-तरफा) आ अंडा कें संख्या मे मामूली कमी आयल छल (पी = 0.088, मान-व्हिटनी परीक्षण, दू-तरफा) , जखन कि स्पॉनिंग दर प्रभावित नहि भेल (पी = 0.94, फिशर कें सटीक परीक्षण, दू-तरफा).सब पैनल मे, n जैविक रूप सं स्वतंत्र मच्छर नमूनाक कें संख्या कें प्रतिनिधित्व करयत छै.एनएस, महत्वपूर्ण नहि.*पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001, ****पी < 0.001 के।
अगिला, हमनें आकलन करलकै कि मादा म॑ संभोग प्रतिरोध पैदा करै लेली एकडाइसोन डिफॉस्फोरिलेशन महत्वपूर्ण छै कि नै.उल्लेखनीय रूप स॑, ईपीपी-क्षीण नर के साथ संभोग करलऽ मादा न॑ अतिरिक्त (ट्रांसजेनिक) नर (चित्र 3c) के संपर्क म॑ ऐला प॑ नियंत्रण मादा (10.4%) के तुलना म॑ बहुत अधिक आवृत्ति (44.9%) प॑ पुनः संभोग करलकै (चित्र 3c).हमरा सब न॑ प्रजनन क्षमता म॑ भी काफी कमी देखलऽ गेलै (चित्र 3c). 3d, बायां) आरू ई मादा द्वारा देलऽ गेलऽ अंडा के संख्या म॑ मामूली कमी (चित्र 3d, बीच), जबकि मादा द्वारा देलऽ गेलऽ अंडा के प्रतिशत (मादा म॑ संभोग स॑ उत्पन्न एगो आरू प्रतिक्रिया )) प्रभावित नै छेलै (चित्र 3d, दाहिना) ।3D20E22P लेली ईपीपी केरऽ देखलऽ गेलऽ विशिष्टता क॑ देखत॑ हुअ॑ ई परिणाम स॑ पता चलै छै कि के सक्रियण संभोग कें दौरान स्थानांतरित ईपीपी द्वारा 3D20E कें आगू संभोग कें लेल महिला ग्रहणशीलता कें बंद करय मे महत्वपूर्ण भूमिका भ सकय छै, जे एकटा एहन व्यवहार छै जे पहिने 20E कें यौन स्थानांतरण कें कारण मानल गेल छै.अतः, इ नर-विशिष्ट हार्मोन महिला प्रजनन क्षमता कें सेहो मजबूती सं प्रभावित करय छै.
अगिला, हम रासायनिक रूप स संश्लेषित 3D20E (चित्र 4a-c) आ व्यावसायिक रूप स उपलब्ध 20E क उपयोग कए यौन रूप स परिपक्व कुमारि मे इंजेक्शन प्रयोग मे 20E आ 3D20E क गतिविधि क तुलना केलहुं।हम देखलहुं जे 3D20E दूनू सांद्रता (चित्र 4d) पर संभोग क प्रति महिला संवेदनशीलता कए बंद करबा मे 20E स काफी बेसी प्रभावी छल एलआरटी म॑ 3D20E के शारीरिक स्तर (1,066 पीजी इंजेक्शन के बाद बनाम 2,022 पीजी संभोग के बाद) न॑ दुर्दम्य मादा के एक अनुपात क॑ प्रेरित करलकै जे 20E (361 पीजी इंजेक्शन के बाद) के शारीरिक स्तर स॑ 20 गुना अधिक छेलै, इंजेक्शन के 24 घंटा बाद सबसें अधिक सांद्रता म॑ 18 पीजी संभोग के बाद; विस्तारित आंकड़ा तालिका 1).ई परिणाम इ धारणा कें अनुरूप छै की 20E कें यौन स्थानांतरण संभोग प्रतिरोधी अवधि कें कारण नहि बनय छै, आ आगू माता-पिता-बच्चा संबंध सुनिश्चित करय मे एकटा प्रमुख कारक कें रूप मे 3D20E कें ओर इशारा करय छै.3D20E कुंवारी मादाक मे अंडा देनाय परख मे 20E सं सेहो काफी बेसि सक्रिय छल (चित्र 4e), जे इ दर्शाबै छै कि सामान्य अंडा देनाय कें दर हम आंशिक ईपीपी साइलेंसिंग के बाद देखलऽ गेलऽ अवशिष्ट 3D20E गतिविधि के उपस्थिति के कारण छेलै जे अखनी भी संभोग-प्रेरित महिला कारक द्वारा उत्पादित छेलै ।
(a,b) 20E (a) स॑ रासायनिक रूप स॑ संश्लेषित 3D20E बहुत उच्च रूपांतरण/दक्षता के साथ (तीन स्वतंत्र संश्लेषण प्रतिक्रिया स॑ औसत ± sem के रूप म॑ प्रस्तुत आंकड़ा) (b).c, मास स्पेक्ट्रम (नीचा आधा) संभोग करलऽ गेलऽ महिला एलआरटी (ऊपर आधा) म॑ मिलै वाला ecdysone स॑ ठीक मेल खाबै छै (ऊपर आधा).d, 20E (0.63 μg, P = 0.02;0.21 μg, P < 0.0001; (0.63 μg, पी = 0.0002; 0.21 μg, पी = 0.54; फिशर कें सटीक परीक्षण, 2-पक्षीय).e, 3D20E इंजेक्शन 10% इथेनॉल नियंत्रण (0.21 μg, पी <0.0001; 0.13) कें अपेक्षा कुंवारी मादा मे काफी अधिक स्पॉनिंग दर प्रेरित करलकय μg, P = 0.0003; अधिक खुराक (0.21 μg, पी = 0.0019; 0.13 μg, पी = 0.075; फिशर कें सटीक परीक्षण, दू-तरफा).सब पैनल मे, n जैविक रूप सं स्वतंत्र मच्छर नमूनाक कें संख्या कें प्रतिनिधित्व करयत छै.एनएस, महत्वपूर्ण नहि.* पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001, ****पी < 0.001.डेटा तीन प्रतिकृति स अछि।
पिछला अध्ययनक मे, हमनें निर्धारित करलकय कि स्टेरॉयड हार्मोन कें यौन स्थानांतरण MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) कें अभिव्यक्ति कें प्रेरित करय छै, जे एकटा महिला प्रजनन जीन छै जे ए.गैम्बिया महिलाक कें पी. फाल्सीपेरम संक्रमण सं बचाव करय छै स्वास्थ्य लागत 13, 13, सबसे घातक मानव मलेरिया परजीवी कें कारण मलेरिया-स्थानीय क्षेत्र, हमनें ई निर्धारित करै के फैसला करलकै कि कोन हार्मोन 3D20E या 20E ई जीन के अभिव्यक्ति क॑ ट्रिगर करै छै.हमरा पता चललै कि जब॑ कि 20E इंजेक्शन न॑ विशेष रूप स॑ या अधिक शक्तिशाली रूप स॑ कुछ न्यूक्लियर हार्मोन रिसेप्टर्स (HR), जेना कि HR3 आरू HR4, आरू विशिष्ट डाउनस्ट्रीम स्टेरॉयड लक्ष्य, जेना कि yolkogenic जीन Vg14, 15, 16, MISO अधिक छेलै मजबूती स॑ 3D20E (विस्तारित आंकड़ा चित्र 3) द्वारा प्रेरित करलऽ गेलऽ छेलै ।एहि तरह स॑, ई एण्ड्रोजेनिक स्टेरॉयड हार्मोन केरऽ यौन स्थानांतरण ऐन्हऽ तंत्र क॑ प्रेरित करै वाला प्रतीत होय छै जे महिला क॑ परजीवी संक्रमण स॑ पैदा होय वाला लागत स॑ बचाबै छै.एकरऽ अलावा, 3D20E ई रिसेप्टर EcR केरऽ दूनू आइसोफॉर्म क॑ अंतर स॑ प्रभावित करै छै, जेकरा स॑ EcR-A आरू दबाबै के प्रेरणा मिलै छै EcR-B, आरू एचपीएक्स15 सहित अन्य संभोग-प्रेरक जीन कें अधिक मजबूती सं ट्रिगर करनाय, जे महिला प्रजनन क्षमता कें प्रभावित करय छै.ई ईपीपी-चुप कराएल गेल नर सं संभोग करय वाला मादा मे देखल गेल महत्वपूर्ण बांझपन कें व्याख्या कयर सकय छै (विस्तारित आंकड़ा चित्र 3).ई आंकड़ा दू एकडीसोन हार्मोन कें द्वारा प्राथमिकता सं सक्रिय डाउनस्ट्रीम मार्गक कें अस्तित्व कें सुझाव देयत छै जे लिंग-विशिष्ट कार्य कें आधार भ सकय छै.
अगिला, हमनें अपनऽ जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन म॑ पहचानलऽ गेलऽ दू EcK जीन केरऽ कार्य के परीक्षण करलकै ।EcK1 या EcK2 क॑ चुप करला स॑ पुरुषऽ म॑ महत्वपूर्ण मृत्यु दर (विस्तारित डाटा चित्र 4a) होय गेलै, जेकरा स॑ पता चलै छै कि ecdysone फॉस्फोरिलेशन, आरू ई तरह निष्क्रियता, जीवित रहै लेली महत्वपूर्ण छै ।क्योंकि EcK2 क॑ EcK1 स॑ उच्च स्तर प॑ व्यक्त करलऽ गेलऽ छेलै आरू MAGs म॑ पता चललै proteomics (चित्र 2b,c आरू पूरक तालिका 2), हमन॑ 20E के साथ इन्क्यूबेशन करक॑ एकरऽ ecdysteroid kinase गतिविधि क॑ मान्य करलकै, जेकरऽ परिणामस्वरूप फॉस्फोरिलेशन 20E22P (विस्तारित डाटा चित्र 2).4b).4b). 3D20E कें बजाय 20E EcK2 कें पसंदीदा लक्ष्य भ सकय छै.
हमरऽ आरएनए-seq विश्लेषण के अनुसार, EcK2 कुंवारी मादा के एलआरटी म॑ भी बहुत अधिक व्यक्त करलऽ गेलऽ छेलै, जहां संभोग के बाद एकरा बंद करी देलऽ गेलऽ छेलै (चित्र 2b).हम॑ ई आंकड़ऽ के पुष्टि करलकै आरू ई निर्धारित करलकै कि EcK2 अभिव्यक्ति रक्त खिला स॑ प्रभावित नै होय छै (विस्तारित आंकड़ा चित्र 5a).हमरऽ प्रारंभिक एमएस प्रयोग क॑ विस्तारित करी क॑ हमन॑ ई निर्धारित करलकै कि 20E22P केरऽ चोटी चोटी स॑ निकटता स॑ संबंधित छै कें 20E (रक्त भोजन कें बाद 22-26 घंटा; विस्तारित आंकड़ा चित्र 5b).कुंवारी महिलाक मे EcK2 कें मौन करय कें परिणामस्वरूप रक्त भोजन कें बाद 26 घंटा पर 20E सं 20E22P कें सापेक्ष अनुपात मे 3 गुना वृद्धि भेल (विस्तारित आंकड़ा चित्र 2c आ 5c), जे इ पुष्टि करय छै कि EcK2 मे 20E कें सेहो फॉस्फोरिलेशन करय छै मादा.उल्लेखनीय रूप सं, EcK2-क्षीण कुमारि पूर्ण यौन ग्रहणशीलता (विस्तारित आंकड़ा चित्र 5d,e) कें बनाए रखलक, जे आगू बतायत छै की 20E कें मादा उत्पादन संभोग दुर्दम्य अवधि कें प्रेरित नहि करएयत छै.हालांकि, इ मादाक मे नियंत्रण कें तुलना मे अंडा देनाय कें दर मे काफी वृद्धि भेल छल, जइ मे 30% सं बेसि कुमारि अंडा देनाय छल (विस्तारित आंकड़ा चित्र. 5f).यदि ब्लड फीडिंग कें बाद डबल-स्ट्रैंड Eck2 RNA (dsEcK2) इंजेक्शन देल गेलय त स्पॉनिंग नहि भेल, जइ बिंदु पर रक्त कें सेवन कें कारण 20E पीक मे कमी आबि गेल छल.कुल मिलाकय, इ परिणाम एकटा मॉडल कें समर्थन करयत छै जे रक्त चूसय कें बाद उत्पन्न 20E स्पॉनिंग कें प्रेरित कयर सकय छै, मुदा तखनहि जखन स्पॉनिंग ब्लॉक (EcK2 आ संभवत: अन्य कारक) घुमायल जायत छै off by mating.न त 20E आरू न ही 3D20E इंजेक्शन न॑ कुंवारी म॑ EcK2 अभिव्यक्ति क॑ रोकलकै (विस्तारित आंकड़ा चित्र 5g), जेकरा स॑ पता चलै छै कि अन्य कारक ई किनेज़ केरऽ निरोध के मध्यस्थता करै छै.हालांकि, रक्त खिला के बाद 20E के स्तर संभोग म॑ असुविधा पैदा करै लेली पर्याप्त नै छेलै, लेकिन प्रभावी रूप स॑ यौन स्थानांतरित 3D20E के उच्च टीटर स॑ ट्रिगर करलऽ गेलऽ छेलै ।
हमरऽ परिणाम ए.गैम्बिया केरऽ प्रजनन सफलता क॑ नियंत्रित करै वाला तंत्र के बारे म॑ महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करै छै ।एक मॉडल सामने ऐलऽ छै, जहां नर 3D20E केरऽ उच्च टीटर के संश्लेषण करै लेली विकसित होय गेलऽ छै, जे एगो नर-विशिष्ट संशोधित एकडाइसोन छै जे मादा क॑ आगू के संभोग के प्रति संवेदनहीन करी क॑ माता-पिता क॑ आश्वासन दै छै ।एक ही समय म॑ ई मलेरिया संवाहक न॑ भी सक्रिय करै लेली एगो कुशल प्रणाली के विकास करलकै पुरुष-विशिष्ट ईपीपी के यौन स्थानांतरण के प्रतिक्रिया में महिला में 3D20E.हमरऽ जानकारी के अनुसार, ई कीड़ा-मकोड़ा में एक अद्वितीय आरू महत्वपूर्ण कार्य करै वाला नर- आरू महिला-प्रधान स्टेरॉयड हार्मोन प्रणाली के पहिलऽ उदाहरण छै.पुरुष-विशिष्ट एकडाइसोन कार्य के अनुमान लगाय देलऽ गेलऽ छै लेकिन निश्चित रूप स॑ प्रदर्शित नै करलऽ गेलऽ छै.उदाहरण के लेलऽ, एक बहुत हद तक खंडन परिकल्पना 18 ई छै कि ई कार्य के द्वारा निष्पादित करलऽ जाब॑ सकै छै 20E पूर्ववर्ती E1.ई सर्वविदित छै कि ड्रोसोफिला म॑ मोनाड्री छोटऽ सेक्स पेप्टाइड केरऽ यौन स्थानांतरण स॑ शुरू होय छै19,20 जे विशिष्ट सेक्स पेप्टाइड रिसेप्टर्स के माध्यम स॑ महिला प्रजनन पथ क॑ नसबंदी करै वाला न्यूरॉन्स के साथ बातचीत करै छै21,22.ए.गैम्बिया महिला म॑ 3D20E द्वारा नियंत्रित डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड क॑ निर्धारित करै लेली आरू काम के जरूरत छै आ इ निर्धारित करय कें लेल की इ झरना मच्छर आ ड्रोसोफिला कें बीच संरक्षित कैल जा सकय छै या नहि.
हमर अध्ययन मे पहचानल गेल महिला प्रजनन क्षमता आ व्यवहार पर 3D20E कें महत्वपूर्ण भूमिका कें देखतय, 3D20E संश्लेषण आ सक्रियण कें तरफ ले जाय वाला मार्ग भविष्य कें मच्छर नियंत्रण रणनीतियक कें लेल नव अवसर प्रदान करयत छै, जेना बाँझ कीट प्रौद्योगिकी रणनीतियक मे प्रतिस्पर्धी बाँझ नर कें पीढ़ी जंगली रिलीज कें लेल या कुंवारी खेल मे 3D20E कें नकल करय कें लेल उपयोग करूं.The 3D20E केरऽ पुरुष-विशिष्ट कार्य तखनिये विकसित होय सकै छै जब॑ ए.गैम्बिया आरू अन्य सेलिया प्रजाति न॑ अपनऽ वीर्य क॑ संभोग प्लग म॑ जमा करै के क्षमता प्राप्त करलकै, कैन्हेंकि ई बड़ऽ संख्या म॑ हार्मोन आरू हार्मोन-सक्रिय एंजाइमऽ के कुशल स्थानांतरण के अनुमति दै छै ।बदली म॑, मोनाड्री क॑ लागू करै वाला 3D20E विकास मादा लेली (MISO केरऽ उच्च अभिव्यक्ति के माध्यम स॑) ओकरऽ पक्ष म॑ एक तंत्र प्रदान करै छै उच्च मलेरिया प्रसार वाला क्षेत्रक मे प्रजनन फिटनेस, जे अप्रत्यक्ष रूप सं प्लाज्मोडियम संचरण मे योगदान दैत छै.ई देखैत जे महिला 20E कें मादा एनोफिलिस मच्छर मे पी. फाल्सीपेरम कें जीवित रहय आ विकास पर गहरा प्रभाव देखल गेल छै,24 नर आ मादा दूनू स्टेरॉयड हार्मोन मार्ग आब मच्छर-पराजीवी अंतःक्रियाक कें प्रमुख पहलू छै.
ए.गैम्बिया जी 3 उपभेदक कें मानक कीट परिस्थितिक (26-28 डिग्री सेल्सियस, 65-80% सापेक्षिक आर्द्रता, 12:12 घंटा प्रकाश/अंधेरा प्रकाश अवधि) मे पालन कैल गेलय.लार्वा कें पाउडर मछली कें भोजन (टेट्रामिन ट्रॉपिकल फ्लेक्स, कोइ गोली आ टेट्रा पोंड स्टिक 7:7:2 कें अनुपात मे) सं खिलाएल गेलय.वयस्क मच्छर कें एड लिबिटम 10% डेक्स्ट्रोज घोल आ साप्ताहिक मानव रक्त (अध्ययन रक्त घटक) देल गेलय.कुंवारी मच्छर कें सूक्ष्मदर्शी सं छोर कें जांच कें बाद प्यूपल स्टेज मे लिंग कें अलग करय सं प्राप्त कैल गेलय.DsRed ट्रांसजीन कें वाहक नर कें वर्णन पहिने कैल गेल छै.
जबरन संभोग प्रयोगक कें पहिले वर्णित प्रोटोकॉल कें अनुसार कैल गेलय.प्राकृतिक संभोग कें लेल, 4 दिन कें कुमारी मादाक कें यौन रूप सं परिपक्व कुमारी नर कें साथ दू रात तइक 1:3 अनुपात मे राखल गेलय.प्रयोगक कें लेल जइ मे नर कें dsEPP कें इंजेक्शन देल गेलय, सह-पिंजरा इंजेक्शन कें बाद 3-4 दिनक कें साथ मेल खायत छल, जखन फॉस्फेटेज गतिविधि कें अधिकतम चुप कैल गेलय (विस्तारित डेटा चित्र 2ख)।
मच्छर के ऊतक, शेष शव (शरीर के बाकी हिस्सा), या पूरा शरीर के 100% मेथनॉल में विच्छेदित करलऽ गेलऽ छेलै आरू एक बीडर (2 मिमी ग्लास बीड्स, 2,400 आरपीएम, 90 सेकंड) स॑ समरूप करलऽ गेलऽ छेलै ।ऊतक के मात्रा आरू मेथनॉल के मात्रा निम्नलिखित छेलै: बाकी शरीर, 1,000 μl म॑ 50; मैग, 50-100 80 μl; महिला एलआरटी, 25–50 80 μl.अवक्षेप मेथनॉल कें समान मात्रा कें साथ एकटा दोसर मेथनॉल निष्कर्षण कें अधीन कैल गेलय.कोशिका मलबा कें अपकेंद्रित्रण सं हटा देल गेलय.दुनू निष्कर्षण सं मेथनॉल कें संयोजित करल गेलय आ नाइट्रोजन प्रवाह कें तहत सुखायल गेलय, तखन पानी मे 80% मेथनॉल कें निम्नलिखित आयतन मे पुनः लटका देल गेलय: शरीर कें बाकी हिस्सा, 50 μl के; एमएजी आ महिला एलआरटी, 30 μl।
नमूनाक कें विश्लेषण एकटा एलसी उपकरण (वैंक्विश, थर्मो फिशर) सं युग्मित मास स्पेक्ट्रोमीटर (आईडी-एक्स, थर्मो फिशर) पर कैल गेलय.5 μl नमूना कें 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखल गेल 3 माइक्रोन, 100 × 4.6 मिमी कॉलम (इंस्पायर सी8, डिक्मा) पर इंजेक्ट कैल गेलय.एलसी कें लेल मोबाइल चरण ए (पानी, 0.1%) छल. फॉर्मिक एसिड) आ बी (एसीटोनिट्राइल, 0.1% फॉर्मिक एसिड)।एलसी ढाल निम्नलिखित छल: 5% बी 1 मिनट के लेल, फेर 11 मिनट पर 100% बी तक बढ़ल।100% पर 8 मिनट के बाद, 4 मिनट के लेल 5% बी पर कॉलम के पुनः संतुलित करू।प्रवाह दर 0.3 मिलीलीटर छल मिनट-1.एमएस स्रोत में आयनीकरण अछि सकारात्मक आरू नकारात्मक मोड म॑ गरम इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण द्वारा पूरा करलऽ जाय छै ।
मास स्पेक्ट्रोमीटर पूर्ण एमएस मोड म॑ 60,000 रिजोल्यूशन प॑ 350 स॑ 680 तलक के m/z रेंज म॑ डाटा क॑ मापै छै ।एमएस/एमएस डाटा क॑ [M + H]+ (सब लक्ष्य), [M - H2O + H]+ (सब लक्ष्य), आरू [M - H]- (फॉस्फोरिलेशन लक्ष्य) प॑ प्राप्त करलऽ गेलऽ छेलै ।एमएस/एमएस डाटा के उपयोग लक्ष्य केरऽ ecdysone गुण के पुष्टि करै लेली करलऽ गेलऽ छेलै उपलब्ध छल.गैर-लक्षित एकडीस्टेरॉइड कें पहचान करय कें लेल, >15% सापेक्षिक प्रचुरता वाला सब एचपीएलसी चोटी कें लेल एमएस/एमएस डेटा कें विश्लेषण कैल गेलय.एकटा पुरुष मे पाएल गेल मात्रा कें साथ ओकर समतुल्यता कें गणना करय कें लेल एकटा विशिष्ट नमूना (अन्य सब लक्ष्य) कें निरपेक्ष मात्रा या पतलापन कें गणना करय कें लेल शुद्ध मानक (20E, 3D20E) सं बनायल गेल मानक वक्र कें उपयोग करय कें मात्रा निर्धारित करय.For 3D20E, मात्रा निर्धारण निम्नलिखित एड्यूक्ट्स के योग के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.डेटा निकाललऽ गेलऽ छेलै आरू ट्रेसफाइंडर (संस्करण 4.1) के उपयोग स॑ मात्रा निर्धारित करलऽ गेलऽ छेलै ।एमएस/एमएस डाटा क॑ Xcalibur (संस्करण 4.4) के उपयोग स॑ विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै ।ई, 20E के एमएस स्पेक्ट्रा आरू 3D20E क॑ संबंधित मानक स॑ तुलना करलऽ गेलऽ छेलै ।3D20E22P क॑ गिरार्ड केरऽ अभिकर्मक स॑ व्युत्पन्नीकरण द्वारा विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै ।20E22P क॑ m/z अनुपात स॑ विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै ।
3D20E22P क॑ MAG स॑ शुद्ध करलऽ गेलऽ छेलै ।शुद्धिकरण क॑ विश्लेषणात्मक पैमाना प॑ एक अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ (Acquity, Waters) के उपयोग करी क॑ एक चतुर्ध्रुवीय द्रव्यमान आधारित डिटेक्टर (QDa, Acquity, Waters) के साथ वही एलसी परिस्थिति म॑ एचपीएलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के रूप म॑ ट्रिगर करलऽ गेलऽ छेलै ।अंश संग्रह ट्रिगर करलऽ गेलऽ छेलै जब॑ 3D20E22P स॑ मेल खायत m/z छेलै पहिने निर्धारित समान अवधारण समय पर पता चलल छल.तखन निकालल गेल यौगिक कें शुद्धता कें जांच एचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा कैल गेलय जैना की ऊपर वर्णित छै.
निर्माता कें निर्देशक कें पालन करयत TRI अभिकर्मक (थर्मो फिशर) कें उपयोग सं 10-12 प्रजनन ऊतकक या शरीर कें अन्य भागक (सिरहीन) सं कुल आरएनए निकालल गेलय.आरएनए कें TURBO DNase (Thermo Fisher) सं उपचारित करल गेलय.cDNA कें संश्लेषण कें बाद Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) कें उपयोग सं करल गेलय निर्माता कें निर्देश.रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर; विस्तारित डाटा तालिका 2) कें लेल प्राइमर पहिने प्रकाशित कैल गेलय24 या प्राइमर-BLAST26 कें उपयोग सं डिजाइन कैल गेलय छल, जइ मे आकार मे 70-150 बीपी कें उत्पादक कें प्राथमिकता देल गेलय आ एक्सोन-एक्सॉन जंक्शन या प्राइमर जोड़ी प्राइमर तीन सं चारि जैविक प्रतिकृति अलग-अलग एक्सोन.cDNA नमूना आरटी-क्यूपीसीआर कें लेल पानी मे चार गुना पतला करल गेलय छेलै.मात्रा निर्धारण 15 μl प्रतिकृति प्रतिक्रियाक मे करल गेलय छेलै जेकरा मे 1× पावरअप एसवाईबीआर ग्रीन मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर), प्राइमर, आरू 5 μl पतला सीडीएनए शामिल छेलै.प्रतिक्रियाक कें क्वांटस्टूडियो 6 प्रो रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर) पर चलाएल गेलय छेलै आरू डिजाइन आरू विश्लेषण (संस्करण 2.4.3).जैना कि अइ अध्ययन मे प्रदर्शित कैल गेल छै, सापेक्षिक मात्रा कें राइबोसोमल जीन RpL19 (AGAP004422) कें लेल सामान्य कैल गेलय, जेकर अभिव्यक्ति मे रक्त खिला 27 या संभोग 3 कें साथ कोनों महत्वपूर्ण बदलाव नहि भेलय.
आरएनए गुणवत्ता कें जांच एजिलेंट बायोएनालाइजर 2100 बायोएनालाइजर (एजिलेंट) कें उपयोग सं करल गेलय छेलै.इलुमिना पेयर-एंड लाइब्रेरी तैयार करल गेलय छेलै आरू एमआईटी आरू हार्वर्ड कें ब्रॉड इंस्टीट्यूट मे चलाएल गेलय छेलै.अनुक्रमण रीड्स कें डिफ़ॉल्ट पैरामीटर कें साथ HISAT2 (संस्करण 2.0.5) कें उपयोग सं ए (MAPQ) स्कोर <30 क॑ Samtools (संस्करण 1.3.1) के उपयोग करी क॑ हटाय देलऽ गेलऽ छेलै ।जीन प॑ मैप करलऽ गेलऽ रीड्स के संख्या क॑ डिफ़ॉल्ट पैरामीटर के साथ htseq-count (संस्करण 0.9.1) के उपयोग करी क॑ गिनलऽ गेलऽ छेलै ।सामान्य रीड गिनती के गणना करलऽ गेलऽ छेलै आरू आर (संस्करण 4.0.3) म॑ DESeq2 पैकेज (संस्करण 1.28.1) के उपयोग करी क॑ विभेदक जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै ।
एकडाइसोन-संशोधक जीन उम्मीदवारक कें पहचान सबसें पहिले पीएसआई-ब्लास्ट एल्गोरिथ्म (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) कें उपयोग सं ए.गैम्बिया जीनोम कें खोज करय सं करल गेलय छेलै, डिफ़ॉल्ट मान निम्नलिखित क्वेरी प्रोटीन अनुक्रमक कें साथ पैरामीटर कें उपयोग सं: Bombyx mori (Accession No. एनपी_001038956.1), मुस्का डोमेस्टिका (अभिगमन संख्या एक्सपी_005182020.1, एक्सपी_005175332.1 आ एक्सपी_011294434.1) आ माइक्रोप्लाटिस डिमोलिटर (अभिगमन संख्या एक्सपी_008552646.1 आ एक्सपी_008552645.1)। बी मोरी (अभिगमन संख्या एनपी_001036900), ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (अभिगमन संख्या एनपी_651202), एपिस मेलिफेरा (अभिगमन संख्या एक्सपी_394838) आ एसीर्थोसिफोन पिसम (अभिगमन संख्या एक्सपी_001947166) स EcK; आरू बी.मोरी (अभिगमन संख्या XP_001947166) एनपी_001177919.1 आरू एनपी_001243996.1) आरू डी. मेलानोगास्टर (अभिगमन संख्या एनपी_572986.1) के ईओ (चरण 1) स॑ ईपीपी.अगला, उच्च mRNA अभिव्यक्ति (>100) के आधार प॑ फिल्टर हिट गाम्बिया मे प्रजनन ऊतक (महिला एलआरटी या एमएजी) मे प्रति मिलियन मैप कैल गेल रीड्स (FPKM) या >85%) टुकड़ा/किलोबेस एक्सोन (चरण 2) । विशिष्टता म॑ सुधार लेली, हमन॑ उम्मीदवार एंजाइमऽ के चयन करलकै जे ए.अल्बिमैनस केरऽ प्रजनन ऊतक म॑ भी व्यक्त होय छै, जे एगो एनोफिलीज प्रजाति छै जे संभोग के दौरान एकडाइसोन के संश्लेषण या स्थानांतरण नै करै छै ।उम्मीदवार जीन क॑ ए.अल्बिमैनस प्रजनन ऊतक (चरण 3) म॑ कम अभिव्यक्ति (<100 FPKM या <85 वीं परसेंटाइल) के आधार प॑ छानलऽ गेलऽ छेलै ।एक अंतिम फिल्टर (चरण 4), एक अंतिम फिल्टर (चरण 4), उम्मीदवार जीन कें निम्नलिखित मे सं कम सं कम एकटा कें संतुष्ट करय कें जरूरत छै: (1) विभेदक रूप सं अभिव्यक्त जीन कें विश्लेषण कें अनुसार संभोग कें बाद काफी अप-रेगुलेट (P < 0.05) आ (2) गैर-प्रजनन ऊतकक मे (< 85 % या <100 FPKM) ।
हमनें पूरा जीव समस्थानिक लेबलिंग प्राप्त करय कें लेल पहिले वर्णित विधियक 28,29,30 संशोधित करलकय.संक्षेप मे, जंगली प्रकार कें सैकरोमाइसिस सेरेविसिया प्रकार II (YSC2, सिग्मा) कें परीक्षण खमीर नाइट्रोजन आधार (बीडी Difco, DF0335) मे करल गेलय छेलै जेकरा मे (wt/vol) 2% ग्लूकोज (G7528, Sigma), 1.7% युक्त छेलै. अमीनो एसिड मुक्त एवं अमोनियम सल्फेट। कल्चर मीडियम) आ 5% 15N अमोनियम सल्फेट (एनएलएम-713, >99%, कैम्ब्रिज आइसोटोप लैबोरेटरीज) कें नाइट्रोजन कें एकमात्र स्रोत कें रूप मे.खमीर कें अपकेंद्रित्रण सं बरामद कैल गेलय आ मच्छर कें लार्वा कें प्यूपेशन तइक एड लिबिटम खिलाएल गेलय.चौथा इंस्टार कें रोकय कें लेल मछली कें आटा (0.5 मिलीग्राम प्रति 300 लार्वा) कें साथ पूरक मृत्यु दर.तखन संभोग कें दौरान स्थानांतरित नर प्रोटीओम कें विश्लेषण कें लेल बिना लेबल वाला नर कें साथ संभोग प्रयोग मे केवल मादाक कें उपयोग कैल गेलय.
4-6 दिन कें 15N टैग कैल गेल कुंवारी मादाक कें उम्र सं मेल खाएय वाला बिना टैग कैल गेल कुंवारी नर सं संभोग करय कें लेल मजबूर कैल गेलय.एपिफ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी कें तहत संभोग प्लग कें पता लगा क सफल संभोग कें सत्यापन कैल गेलय.3, 12, आ 24 एचपीएम पर 45-55 संभोग करय वाला मादाक कें अलिंद कें 50 μl अमोनियम मे विच्छेदित कैल गेलय बाइकार्बोनेट बफर (पीएच 7.8) आ मूसल सं समरूप बनायल गेलय.होमोजीनेट कें अपकेंद्रित्रित कैल गेलय आ सुपरनेटेंट कें 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट मे 50 μl 0.1% RapiGest (186001860, Waters) सं मिला देल गेलय.प्रत्येक नमूना सं सुपरनेटेंट आ गोली कें सूखा बर्फ पर स्नैप फ्रीज करल गेलय आ रात भर मे भेजल गेलय वाशिंगटन विश्वविद्यालय म॑ मैककोस प्रयोगशाला, जहाँ एलसी-एमएस/एमएस के लेलऽ नमूना तैयारी पूरा होय गेलऽ छेलै ।गोली क॑ 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट म॑ 0.1% RapiGest के 50 μl म॑ पुनः निलंबित करी क॑ पानी के स्नान म॑ सोनिकेट करी क॑ ।गोली आरू सुपरनेटेंट केरऽ प्रोटीन सांद्रता क॑ बीसीए परख स॑ मापलऽ गेलऽ छेलै, नमूना क॑ 5 एमएम डिथियोथ्रेइटोल स॑ कम करलऽ गेलऽ छेलै (डीटीटी; सिग्मा), 15 एमएम आयोडोएसिटामाइड (सिग्मा) स॑ अल्काइलेशन आरू 37 डिग्री सेल्सियस (1:0 50) प॑ 1 घंटा तलक ट्रिप्सिनीकरण: ट्रिप्सिन:सबस्ट्रेट अनुपात के साथ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै 14,000 आरपीएम कें लेल 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट कें लेल मलबा हटावय कें लेल.नमूना कें ड्यूल-मोड ठोस-चरण निष्कर्षण (ओएसिस एमसीएक्स कारतूस, वाटर्स) सं धोल गेलय आ 0.1% फॉर्मिक एसिड मे 0.33 μg μl-1 कें अंतिम प्रोटीन सांद्रता कें लेल पुनः निलंबित करल गेलय.अनलेबल एमएजी प्रोटीओम कें कुंवारी सं समान रूप सं विश्लेषण करल गेलय males.प्रत्येक नमूना कें लेल दू विश्लेषणात्मक प्रतिकृतिक कें विश्लेषण कैल गेलय.अगला, बृहस्पति C12 रिवर्स-फेज राल (Phenomenex) आ 180 मिनट कें तरल क्रोमैटोग्राफी सं पैक 4-सेमी फ्यूज्ड सिलिका Kasil1 (PQ) frit trap कें साथ 25-cm फ्यूज्ड सिलिका 75-μm कॉलम कें उपयोग सं प्रत्येक कें 1 μg कें विश्लेषण करल गेलय. नमूना डाइजेस्ट – एमएस/एमएस क॑ नैनोएसीक्यूटी यूपीएलसी सिस्टम (वाटर्स) के साथ क्यू-एक्सएक्टिव एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर) प॑ चलालऽ गेलऽ छेलै ।प्रत्येक रन लेली उत्पन्न डाटा स॑ संबंधित अधिग्रहण डाटा क॑ प्रोटीओविजार्ड (संस्करण 3.0.20287) के उपयोग करी क॑ आरू प्रोटीन युक्त FASTA डाटाबेस के विरुद्ध Comet31 (संस्करण 3.2) के उपयोग करी क॑ mzML प्रारूप म॑ बदललऽ गेलऽ छेलै एनोफिलीज गैम्बिया (वेक्टरबेस संस्करण ५४), एनोफिलीज कोलुजी स॑ अनुक्रम माली-एनआईएच (वेक्टरबेस संस्करण ५४), सैकरोमाइसिस सेरेविसिया (यूनिप्रोट, मार्च २०२१), ए.गैम्बिया आरएनए-सेक, आरू ज्ञात मानव दूषित पदार्थऽ के तीन-फ्रेम अनुवाद प॑ एक खोज करलऽ गेलऽ छेलै ।पेप्टाइड मैप-मैच एफडीआर के उपयोग करी क॑ निर्धारित करलऽ गेलऽ छेलै 0.01 के सीमा के साथ परकोलेटर32 (संस्करण 3.05), आरू पेप्टाइड क॑ लाइमलाइट33 (संस्करण 2.2.0) म॑ प्रोटीन मितव्ययिता के उपयोग करी क॑ प्रोटीन पहचान म॑ इकट्ठा करलऽ गेलऽ छेलै ।सापेक्ष प्रोटीन प्रचुरता के अनुमान हर रन म॑ हर प्रोटीन के लेलऽ गणना करलऽ गेलऽ सामान्यीकृत स्पेक्ट्रल प्रचुरता कारक (एनएसएएफ) के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै जैसनऽ कि पहले वर्णित करलऽ गेलऽ छेलै ।प्रत्येक प्रोटीन के सापेक्ष एनएसएएफ क॑ दू अलग-अलग जैविक स॑ नमूना भर म॑ औसतन करलऽ गेलऽ छेलै replicates.15N लेबलिंग न॑ सफलतापूर्वक महिला प्रोटीओम क॑ मास्क करलकै, हालांकि लेबल करलऽ गेलऽ कुंवारी स॑ थोड़ी मात्रा म॑ बिना लेबल प्रोटीन के पता लगाय सकलऽ जाय सकै छै ।हम॑ महिला कच्चा नमूना म॑ पुरुष प्रोटीन रिडक्शन (1-5 स्पेक्ट्रा) के पता लगाबै के रिकॉर्डिंग केवल तकनीकी रन म॑ ही करलकै, जहाँ कच्चा नमूना क॑ नर/संभोग नमूना के बाद चलालऽ गेलऽ छेलै, जेकरऽ परिणामस्वरूप एचपीएलसी “कैरी ओवर” के रूप म॑ मिललै लेबल कुमारी सं प्राप्त ‘दूषित पदार्थ’ कें पूरक तालिका 1 मे सूचीबद्ध कैल गेल छै.
जेनस्क्रिप्ट मे दू एंटीजेनिक पेप्टाइड, QTTDRVAPAPDQQQ (आइसोटाइप पीए कें भीतर) आ MESDGTTPSGDSEQ (आइसोटाइप पीए आ पीबी कें भीतर) कें संयोजन कैल गेलय, तखन वाहक प्रोटीन केएलएच सं संयुग्मित कैल गेलय आ न्यूजीलैंड खरगोशक मे इंजेक्शन देल गेलय.खरगोशक कें चारिम इंजेक्शन कें बाद बलि देल गेलय, आ कुल आईजीजी कें आत्मीयता सं अलग कैल गेलय purification.अधिकतम ईपीपी-विशिष्ट खरगोश सं आईजीजी कें उपयोग आगू वेस्टर्न ब्लॉटिंग कें लेल कैल गेलय.
वेस्टर्न ब्लॉट कें लेल, 4 दिन कें कुंवारी नर आ कुंवारी या जबरदस्ती संभोग करय वाला मादा (<10 संभोग कें बाद), प्रोटीन निष्कर्षण बफर (50 एमएम ट्राइस, पीएच 8.0; 1% एनपी-40; 0.25%) सं एमएजी (n = 10, जत n जैविक रूप सं स्वतंत्र मच्छर नमूनाक कें संख्या कें प्रतिनिधित्व करय छै) आ मादा एलआरटी (n = 30) कें लेल. सोडियम डिऑक्सीकोलेट;150 मिमी NaCl;1 एमएम EDTA; °C.प्रोटीन क॑ ब्रैडफोर्ड परख (बायो-रैड) द्वारा मात्रा निर्धारित करलऽ गेलऽ छेलै ।फिर, 20 μg MAG प्रोटीन, 40 μg LRT प्रोटीन, आरू 20 μg अवशिष्ट थोक प्रोटीन क॑ विकृत करलऽ गेलऽ छेलै आरू MOPS बफर केरऽ उपयोग करी क॑ 10% Bis-Tris NuPAGE द्वारा अलग करलऽ गेलऽ छेलै ।प्रोटीन क॑ iBlot2 स्थानांतरण के उपयोग करी क॑ पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड झिल्ली म॑ स्थानांतरित करलऽ गेलऽ छेलै system (Thermo Fisher).झिल्ली क॑ 1× PBS-T (PBS म॑ 0.1% Tween-20) म॑ दू बार धोलऽ गेलऽ छेलै आरू ओकरा बाद 22°C प॑ 1 घंटा तलक ओडिसी ब्लॉकिंग बफर (Li-Cor) म॑ ब्लॉक करलऽ गेलऽ छेलै ।झिल्ली क॑ कस्टम खरगोश एंटी-ईपीपी पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी (ब्लॉकिंग बफर म॑ 1:700) आरू खरगोश स॑ 4 °C प॑ रात भर हिलायलऽ गेलऽ छेलै एंटी-एक्टिन मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी MAC237 (Abeam; 1:4,000).झिल्ली क॑ पीबीएस-टी स॑ धोलऽ गेलऽ छेलै आरू ओकरा बाद 0.01% एसडीएस आरू 0.2% युक्त ब्लॉकिंग बफर म॑ माध्यमिक एंटीबॉडी (गधा एंटी-खरगोश 800CW आरू बकरी एंटी-राट 680LT (Li-Cor), दूनू 1:20,000) स॑ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । 22 °C पर 1 घंटा तइक ट्वीन -20.झिल्ली कें पीबीएस-टी सं धोल गेलय आ ओडिसी सीएलएक्स स्कैनर सं इमेजिंग कैल गेलय.इमेज स्टूडियो (संस्करण 5.2) मे छवि एकत्रित आ संसाधित कैल गेलय.ईपीपी-आरए आइसोफॉर्म (82 केडीए) सं मेल खायत एकटा विशिष्ट बैंड कें पता नहि चलल.
ईपीपी (हिस्टिडीन फॉस्फेटेज डोमेन, एनसीबीआई संरक्षित डोमेन खोज 34 युक्त आइसोफॉर्म AGAP002463-RB के रूप म॑) आरू EcK2 (AGAP002181) केरऽ कोडिंग क्षेत्र क॑ pET-21a(+) प्लाज्मिड (Novagen Millipore Sigma) म॑ क्लोन करलऽ गेलऽ छेलै ; प्राइमरो विस्तारित डाटा तालिका 2.आठ GS4 लिंकर (टैंडम मे) pET-21a(+)-EcK2 निर्माण कें C-टर्मिनल 6xHis टैग सं पहिने डालल गेलय छेलै.पुनर्संयोजित प्रोटीन कें उत्पादन NEBExpress कोशिका मुक्त ई. कोलाई प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रिया (न्यू इंग्लैंड बायोलैब) कें उपयोग सं कैल गेलय छेलै.पुनर्संयोजित प्रोटीन कें NEBExpress Ni स्पिन कॉलम कें उपयोग सं शुद्ध करल गेलय छेलै (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स).डाइहाइड्रोफोलेट रिडक्टेज (DHFR) नियंत्रण प्रोटीन कें उत्पादन NEBExpress सेल-फ्री ई. कोलाई प्रोटीन संश्लेषण किट सं डीएनए टेम्पलेट कें उपयोग सं कैल गेलय.प्रोटीन कें पीबीएस मे 50% ग्लिसरॉल मे -20 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीना तइक संग्रहीत कैल गेलय.
ईपीपी आरू ऊतक अर्क केरऽ फॉस्फेटेज गतिविधि क॑ 4-नाइट्रोफिनाइल फॉस्फेट (पीएनपीपी; सिग्मा-एल्ड्रिच) के उपयोग करी क॑ मापलऽ गेलऽ छेलै ।प्रतिक्रिया बफर म॑ 25 एमएम ट्राइस, 50 एमएम एसिटिक एसिड, 25 एमएम बिस-ट्राइस, 150 एमएम NaCl, 0.1 एमएम ईडीटीए, आरू 1 एमएम डीटीटी छेलै ।उपक्रिया बफर म॑ ऊतक क॑ होमोजेनाइज करलऽ गेलऽ छेलै आरू कोशिका मलबा क॑ अपकेंद्रित्रण द्वारा हटाय देलऽ गेलऽ छेलै ।2.5 मिलीग्राम एमएल-1 पीएनपीपी युक्त प्रतिक्रिया बफर म॑ एंजाइम या ऊतक अर्क मिला क॑ प्रतिक्रिया शुरू करलऽ गेलऽ छेलै ।प्रतिक्रिया मिश्रण क॑ कमरा केरऽ तापमान प॑ अंधेरे म॑ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै, आरू पीएनपीपी स॑ परिवर्तित पीएनपी केरऽ मात्रा क॑ विभिन्न समय प॑ 405 एनएम प॑ अवशोषण क॑ मापी क॑ मात्रा निर्धारित करलऽ गेलऽ छेलै ।
इन विट्रो EcK गतिविधि के लेल, प्रोटीन क॑ 200 μl बफर (pH 7.5) म॑ 0.2 mg 20E या 3D20E के साथ 27 °C प॑ 2 घंटा तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP आरू 10 mM MgCl2 छेलै μl मेथनॉल, तखन -20 °C पर 1 घंटा तइक ठंडा करल गेलय, फेर 20,000 g पर 4 °C पर 10 मिनट तइक अपकेंद्रित्रित करल गेलय.तखन सुपरनेटेंट कें एचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण करल गेलय.नियंत्रण समूह मे उपयोग कैल गेल प्रोटीन कें गर्मी-निष्क्रिय करय कें लेल, प्रोटीन कें 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट कें लेल पीबीएस मे 50% ग्लिसरॉल मे इन्क्यूबेट करल गेलय.
इन विट्रो ईपीपी गतिविधि के लेल, प्रोटीन क॑ 3D20E22P (18 जोड़ी एमएजी म॑ मिललऽ मात्रा के बराबर, एचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा शुद्ध करलऽ गेलऽ मात्रा के बराबर) के साथ 100 μl बफर (पीएच 7.5) म॑ इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै जेकरा म॑ 25 एमएम ट्राइस, 50 एमएम एसिटिक एसिड, 25 एमएम बिस-ट्राइस, 150 एमएम NaCl, 0.1 mM EDTA, आरू 1 mM DTT क॑ 27 °C प॑ 3 घंटा तलक.
ईपीपी (362 बीपी), ईसीके1 (एजीएपी004574, 365 बीपी) आरू ईसीके2 (556 बीपी) के लेलऽ पीसीआर टुकड़ा क॑ मिश्रित-लिंग केरऽ सिरहीन मच्छर शव स॑ तैयार सीडीएनए स॑ प्रवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै ।ईजीएफपी नियंत्रण (495 बीपी) केरऽ पीसीआर टुकड़ा क॑ पहिने वर्णित pCR2.1-eGFP स॑ प्रवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै; पीसीआर प्राइमर कें विस्तारित आंकड़ा तालिका 2 मे सूचीबद्ध कैल गेल छै.पीसीआर टुकड़ा कें pL4440 प्लाज्मिड पर उल्टा T7 प्रोमोटर कें बीच डालल गेलय छेलै.प्लाज्मिड निर्माण कें NEB 5-α सक्षम ई. कोलाई (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) सं बरामद करल गेलय छेलै आ उपयोग सं पहिले डीएनए अनुक्रमण सं सत्यापन करल गेलय छेलै (इंसर्ट अनुक्रम कें लेल पूरक आंकड़ा 1 देखूं).प्राइमर T7 प्रमोटर सं मिलान करल गेलय छेलै (विस्तारित डाटा तालिका 2) कें उपयोग pL4440-आधारित प्लाज्मिड सं इन्सर्ट कें प्रवर्धित करय कें लेल करल गेलय छेलै.पीसीआर उत्पाद आकार कें पुष्टि अगरोज जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा करल गेलय छेलै.dsRNA कें मेगास्क्रिप्ट टी 7 ट्रांसक्रिप्शन किट (थर्मो फिशर) कें उपयोग सं पीसीआर टेम्पलेट सं प्रतिलिपिबद्ध करल गेलय छेलै आ निर्माता कें निर्देशक कें अनुसार पहिने वर्णित संशोधनक कें साथ शुद्ध करल गेलय छेलै.
dsRNA इंजेक्शन के लेल, 1,380 एनजी dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) के 10 एनजी nl-1 के सांद्रता में वयस्क पुरुष या महिला (Nanoject III, Drummond) के वक्ष में एकलोजन के बाद 1 दिन के भीतर इंजेक्शन देल गेल छल.जीन नॉक डाउन के स्तर आरएनए द्वारा कम सं कम तीन जैविक प्रतिकृति में निर्धारित कयल गेल छल निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, आ आरटी-qPCR.ecdysone इंजेक्शन कें लेल, 4 दिन कें कुंवारी या 6 दिन कें कुंवारी खून सं खिलाएल महिलाक कें 0.13, 0.21, या 0.63 μg 20E या 3D20E (Nanoject III, Drummond) कें 1.3, 2.1, कें सांद्रता मे इंजेक्शन देल गेलय छेलै. क्रमशः, प्रयोगात्मक डिजाइन या 6.3 एनजी एनएल-1.पानी मे 100 एनएल 10% (vol/vol) इथेनॉल कें इंजेक्शन कें आधार पर; 100 एनएल 3D20E22P 10% इथेनॉल मे (एक जोड़ी एमएजी मे भेटय वाला मात्रा कें 75% कें बराबर)।मच्छरक कें बेतरतीब ढंग सं इंजेक्शन समूह मे राखल गेलय.
स्पॉनिंग परख कें लेल, 3 दिन कें मादाक कें मानव रक्त पर एड लिबिटम भोजन देल गेलय.आंशिक रूप सं खिलाएल या बिना खिलाएल गेल मच्छरक कें हटा देल गेलय.इलाज कें आधार पर, मादाक कें रक्त भोजन कें कम सं कम 48 घंटा बाद चारि राति कें लेल अलग-अलग स्पॉनिंग कप मे राखल गेलय.अंडा कें गिनती स्टीरियोस्कोप (Stemi 508, Zeiss) कें तहत कैल गेलय; संभोग करय वाला मादा के लेल जे अंडा लार्वा में निकलैत छल ओकरा उपजाऊ मानल जाइत छल |
संभोग परीक्षण कें लेल, मादाक कें संभोग कें प्रतिरोधक क्षमता विकसित करय कें लेल उपचार कें आधार पर कम सं कम 2 दिन कें अनुमति देल गेलय, आ जंगली प्रकार कें उम्र सं मेल खाएय वाला नर कें बाद मे ओही पिंजरा मे डालल गेलय.दू रात बाद, मादा निषेचित पुटिका कें विच्छेदन करल गेलय आ जीनोमिक डीएनए कें फ्रीज-पिघलनाय आ 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल, 2016 युक्त बफर मे सोनिकेशन द्वारा जारी करल गेलय. 1 mM EDTA, आरू 25 mM NaCl (pH 8.2).नमूना क॑ प्रोटीनेज के (0.86 μg μl-1) स॑ 55 °C प॑ 15 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा बाद 95 °C प॑ 10 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै ।कच्चा जीनोमिक डीएनए तैयारी क॑ 10 गुना पतला करलऽ गेलऽ छेलै आरू Y गुणसूत्र अनुक्रम केरऽ qPCR पता लगाबै के अधीन करलऽ गेलऽ छेलै; प्राइमर कें विस्तारित आंकड़ा तालिका 2.वाई गुणसूत्र अनुक्रम कें अभाव संभोग कें संकेत नहि देल गेल छै.
पुनः संभोग परख कें लेल, संभोग कें स्थिति कें पुष्टि करय कें लेल बल सं संभोग करय वाला मादाक कें संभोग प्लग कें उपस्थिति कें जांच कैल गेलय आ नर कें अभाव मे संभोग कें प्रति अप्रतिरोधकता विकसित करय कें लेल 2 दिन कें अनुमति देल गेलय, जैना की पहिले वर्णित छै 36 .DsRed ट्रांसजेनिक शुक्राणु लेवय वाला नर कें तखन मादा पिंजरा मे डालल गेलय.दू रात बाद, निषेचन करय वाला पुटिका कें प्रवेश करल गेलय मादा स॑ विच्छेदित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू जीनोमिक डीएनए क॑ ऊपर वर्णित के अनुसार तैयार करलऽ गेलऽ छेलै आरू DsRed ट्रांसजीन केरऽ qPCR पता लगाबै के अधीन करलऽ गेलऽ छेलै; प्राइमर्स कें विस्तारित आंकड़ा तालिका 2.DsRed ट्रांसजीन कें अनुपस्थिति संकेत देल गेल छै की कोनों पुनः संभोग नहि भेल छै.
3D20E क॑ पहिने वर्णित तरीका स॑ संश्लेषित करलऽ गेलऽ छेलै 37 .संक्षेप म॑ 10 मिलीग्राम 20E (सिग्मा-एल्ड्रिच) क॑ 10 मिलीलीटर पानी म॑ घोललऽ गेलऽ छेलै, जेकरा बाद 30 मिलीग्राम प्लैटिनम ब्लैक (पाउडर के रूप म॑, सिग्मा-एल्ड्रिच) मिलालऽ गेलऽ छेलै ।O2 केरऽ कोमल धारा क॑ लगातार प्रतिक्रिया मिश्रण म॑ बुलबुला करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा कमरा म॑ हिलायलऽ गेलऽ छेलै तापमान.6 घंटा के बाद, 30 एमएल मेथनॉल मिलाकर प्रतिक्रिया रोकल गेल छल.उत्प्रेरक कण के हटाबय लेल मिश्रण के अपकेंद्रित्रित कएल गेल छल.सुपरनेटेंट के कमरा के तापमान पर वैक्यूम मे सूखय तक वाष्पित कयल गेल छल.सुखायल गेल प्रतिक्रिया उत्पाद के एचपीएलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लेल इंजेक्शन के लेल 10% इथेनॉल आ मेथनॉल मे घोलल गेल छल.रूपांतरण दर (20E सं 3D20E) लगभग 97% (चित्र 4b) छेलै, आरू संश्लेषित 3D20E केरऽ एमएस स्पेक्ट्रम संभोग करलऽ मादा (चित्र 4c) म॑ मिलै वाला स्पेक्ट्रम स॑ मेल खाबै छेलै ।
किंवदंती मे कैल गेल सांख्यिकीय परीक्षणक कें विशिष्ट विवरण देल गेल छै.ग्राफपैड (संस्करण 9.0) कें उपयोग फिशर कें सटीक परीक्षण, मंटेल-कॉक्स परीक्षण, आ स्टूडेंट कें टी-परीक्षण करय कें लेल करल गेलय छेलै.कोकरन-मैंटेल-हेनजेल परीक्षण एकटा कस्टम आर स्क्रिप्ट (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test पर उपलब्ध) कें उपयोग सं करल गेलय छेलै.आँकड़ा वितरण कें लेल परीक्षण करल गेलय छेलै 0.05 कें महत्व सीमा कें साथ शापिरो-विल्क परीक्षण कें उपयोग करयत सामान्यता.जखन आंकड़ा सामान्यता परीक्षण मे असफल भ गेलय, तखन मान-व्हिटनी परीक्षण करल गेलय.जीवित रहय कें आंकड़ा कें विश्लेषण Mantel-Cox परीक्षण कें उपयोग सं करल गेलय छेलै.DESeq2 पैकेज (संस्करण 1.28.1) कें उपयोग आरएनए-seq जीन-स्तरीय अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण करय कें लेल करल गेलय छे लै.ग्राफ पर क्षैतिज पट्टी मीडियन कें प्रतिनिधित्व करय छै.ए सब परीक्षणक कें लेल थ्रेशोल्ड कें रूप मे पी = 0.05 कें महत्व मान कें उपयोग करल गेलय छेलै.
अध्ययन डिजाइन के बारे में अधिक जानकारी के लेल, एहि लेख सं लिंक प्रकृति अनुसंधान रिपोर्ट सार देखू.
एमएस प्रोटीओमिक डाटा क॑ डाटासेट पहचानकर्ता पीएक्सडी०३२१५७ के साथ प्राइड पार्टनर रिपोजिटरी (https://www.ebi.ac.uk/pride/) के माध्यम स॑ प्रोटीओमएक्सचेंज कंसोर्टियम (http://proteomecentral.proteomexchange.org) म॑ जमा करलऽ गेलऽ छेलै ।
आरएनए-seq डाटासेट क॑ जीन एक्सप्रेशन कम्प्रीहेंसिव लाइब्रेरी (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) म॑ सीरियल रिकॉर्ड GSE198665 के तहत जमा करलऽ गेलऽ छै ।
वर्तमान अध्ययन कें दौरान उत्पन्न आ/अथवा विश्लेषण कैल गेल अतिरिक्त डाटासेट उचित अनुरोध पर संबंधित लेखक सं प्राप्त कैल जा सकय छै.ई लेख स्रोत डाटा उपलब्ध करबैत छै.
डी लूफ, ए Ecdysteroids: उपेक्षित कीट सेक्स स्टेरॉयड?पुरुष: ब्लैक बॉक्स।कीट विज्ञान.13, 325-338 (2006).
रेडफर्न, सीपीएफ 20-हाइड्रोक्सीएक्डाइसोन एवं एनोफिलीज स्टेफेन्स में अंडाशय के विकास।जे। कीट शरीर क्रिया विज्ञान.28, 97-109 (1982).