इम्यूनोमोड्यूलेटरी मेटाबोलाइट्स ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट (TME) केरऽ एगो प्रमुख विशेषता छै, लेकिन कुछ अपवाद छोड़ी क॑ एकरऽ पहचान बहुत हद तलक अज्ञात छै । यहाँ, हमनें उच्च ग्रेड सीरस कार्सिनोमा (एचजीएससी) के मरीजऽ के ट्यूमर आरू जलन स॑ ट्यूमर आरू टी कोशिका के विश्लेषण करी क॑ ई अलग-अलग टीएमई डिब्बऽ के मेटाबोलोम के खुलासा करलकै । जलन आ ट्यूमर कोशिका मे मेटाबोलाइट्स मे व्यापक अंतर होइत अछि । जलन के तुलना म॑ ट्यूमर म॑ घुसपैठ करै वाला टी कोशिका १-मिथाइलनिकोटिनामाइड (MNA) स॑ काफी समृद्ध होय छै । यद्यपि टी कोशिका म॑ एमएनए केरऽ स्तर बढ़ी जाय छै, लेकिन निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़ (एक एंजाइम जे एस-एडेनोसाइलमेथियोनिन स॑ निकोटिनामाइड म॑ मिथाइल समूहऽ के स्थानांतरण क॑ उत्प्रेरक बनाबै छै) के अभिव्यक्ति फाइब्रोब्लास्ट आरू ट्यूमर कोशिका तलक सीमित छै । कार्यात्मक रूप स॑ एमएनए टी कोशिका क॑ ट्यूमर-प्रोमोटिंग साइटोकिन ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा केरऽ स्राव करै लेली प्रेरित करै छै । अतः टीएमई-व्युत्पन्न एमएनए टी कोशिका केरऽ प्रतिरक्षा नियमन म॑ योगदान दै छै आरू मानव कैंसर केरऽ इलाज लेली एगो संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य के प्रतिनिधित्व करै छै ।
ट्यूमर सं निकलल मेटाबोलाइट्स एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा पर गहन निरोधात्मक प्रभाव डाल सकैत अछि, आ बेसी सं बेसी सबूत बताबैत अछि जे ई रोगक प्रगति के लेल एकटा प्रमुख प्रेरक शक्ति के रूप में सेहो काज क सकैत अछि (1) । वारबर्ग प्रभाव के अलावा, हाल के काम शुरू होय गेलऽ छै कि ट्यूमर कोशिका केरऽ चयापचय अवस्था आरू ट्यूमर सूक्ष्म वातावरण (टीएमई) केरऽ प्रतिरक्षा अवस्था के साथ एकरऽ संबंध के विशेषता छै । माउस मॉडल आरू मानव टी कोशिका प॑ करलऽ गेलऽ अध्ययन स॑ पता चललै छै कि ग्लूटामाइन चयापचय (2), ऑक्सीडेटिव चयापचय (3) आरू ग्लूकोज चयापचय (4) विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका उपसमूह प॑ स्वतंत्र रूप स॑ काम करी सकै छै । ई मार्गऽ म॑ मौजूद कई मेटाबोलाइट्स टी कोशिका केरऽ एंटी-ट्यूमर कार्य क॑ रोक॑ छै । ई सिद्ध होय गेलऽ छै कि कोएंजाइम टेट्राहाइड्रोबायोप्टेरिन (BH4) केरऽ नाकाबंदी टी कोशिका केरऽ प्रसार क॑ नुकसान पहुँचाबै सकै छै, आरू शरीर म॑ BH4 केरऽ वृद्धि स॑ सीडी ४ आरू सीडी ८ के माध्यम स॑ एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ी सकै छै । एकरऽ अलावा, बीएच४ ( 5 ) केरऽ प्रशासन स॑ किनुरेनिन केरऽ इम्यूनोसप्रेसिव प्रभाव क॑ बचालऽ जाब॑ सकै छै । आइसोसाइट्रेट डिहाइड्रोजनेज (आईडीएच) उत्परिवर्तित ग्लियोब्लास्टोमा म॑ एनान्टीओमेटाबोलिक (आर)-2-हाइड्रोक्सीग्लूटारेट (आर-2-एचजी) के स्राव टी सेल सक्रियण, प्रसार आरू साइटोलाइसिस गतिविधि (6) क॑ रोक॑ छै । हाल ही म॑ ई देखलऽ गेलऽ छै कि ग्लाइकोलाइसिस केरऽ उप-उत्पाद मिथाइलग्लाइओक्सल माइलोइड मूल केरऽ सप्रेसर कोशिका द्वारा उत्पादित होय छै आरू मिथाइलग्लाइओक्सल केरऽ टी कोशिका स्थानांतरण प्रभावक टी कोशिका केरऽ कार्य क॑ रोक॑ सकै छै । उपचार म॑ मिथाइलग्लाइओक्सल केरऽ बेअसरीकरण मायलोइड-व्युत्पन्न सप्रेसर कोशिका (MDSC) केरऽ गतिविधि प॑ काबू पा॑ सकै छै आरू माउस मॉडल म॑ चेकपॉइंट नाकाबंदी चिकित्सा क॑ समन्वयात्मक रूप स॑ बढ़ा सकै छै (7) । ई अध्ययन सामूहिक रूप स॑ टी सेल केरऽ कार्य आरू गतिविधि क॑ नियंत्रित करै म॑ टीएमई-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स केरऽ प्रमुख भूमिका प॑ जोर दै छै ।
अंडाशय के कैंसर में टी सेल के विकार के व्यापक रूप स रिपोर्ट कयल गेल अछि ( 8 ) । एकरऽ कुछ हद तलक कारण हाइपोक्सिया आरू असामान्य ट्यूमर संवहनी (9) म॑ निहित चयापचय विशेषता छै, जेकरऽ परिणामस्वरूप ग्लूकोज आरू ट्रिप्टोफैन क॑ लैक्टिक एसिड आरू किनुरेनिन जैसनऽ उप-उत्पाद म॑ बदललऽ जाय छै । अत्यधिक बाह्य कोशिकीय लैक्टेट इंटरफेरोन-γ (IFN-γ) के उत्पादन क॑ कम करै छै आरू माइलोसप्रेसिव उपसमूह ( 10 , 11 ) के भेदभाव क॑ चलाबै छै । ट्रिप्टोफैन केरऽ सेवन सीधे टी सेल प्रसार क॑ रोक॑ छै आरू टी सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग क॑ रोक॑ छै (12-14) । ई अवलोकन के बावजूद, प्रतिरक्षा चयापचय के आसपास बहुत काम अनुकूलित मीडिया के उपयोग करी क॑ इन विट्रो टी सेल कल्चर म॑ करलऽ गेलऽ छेलै, या इन विवो म॑ समरूप माउस मॉडल तलक सीमित छेलै, जेकरा म॑ स॑ कोय भी मानव कैंसर आरू शारीरिक मैक्रो आरू माइक्रो वातावरण के विषमता क॑ पूरा तरह स॑ नै दर्शाबै छै ।
अंडाशय कें कैंसर कें एकटा आम विशेषता छै पेरिटोनियल फैलनाय आ जलन कें उपस्थिति. जलन मे कोशिका द्रव के संचय उन्नत रोग आ खराब पूर्वानुमान ( 15 ) सँ जुड़ल अछि । रिपोर्ट के अनुसार, ई अद्वितीय डिब्बा हाइपोक्सिक छै, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) आरू इंडोलियमाइन 2,3-डाइऑक्सीजनेज (IDO) के उच्च स्तर छै, आरू टी नियामक कोशिका आरू माइलोइड निरोधात्मक कोशिका (15-18) द्वारा घुसपैठ करलऽ जाय छै । जलन केरऽ चयापचय वातावरण खुद ट्यूमर केरऽ वातावरण स॑ अलग होय सकै छै, ई लेली पेरिटोनियल स्पेस म॑ टी कोशिका केरऽ पुनः प्रोग्रामिंग अस्पष्ट छै । एकरऽ अलावा, ट्यूमर केरऽ वातावरण म॑ मौजूद जलन आरू मेटाबोलाइट्स के बीच प्रमुख अंतर आरू विषमता प्रतिरक्षा कोशिका केरऽ घुसपैठ आरू ट्यूमर प॑ ओकरऽ कार्य म॑ बाधा पहुँचा सकै छै, आरू एकरा आरू शोध के जरूरत छै ।
ई समस्या के समाधान के क्रम म॑ हमन॑ अलग-अलग कोशिका प्रकार (सीडी 4 + आरू सीडी 8 + टी कोशिका सहित) के साथ-साथ ट्यूमर के भीतर आरू बीच के अध्ययन लेली एक संवेदनशील कोशिका पृथक्करण आरू तरल क्रोमैटोग्राफी टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) विधि के डिजाइन करलकै एकरऽ मेटाबोलाइट्स रोगी केरऽ एक ही जलन आरू ट्यूमर वातावरण म॑ कोशिका म॑ फैललऽ छै । हम उच्च-आयामी प्रवाह साइटोमेट्री आरू एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNA-seq) के साथ संयोजन म॑ ई विधि के उपयोग करी क॑ ई प्रमुख आबादी के चयापचय स्थिति के उच्च रिजोल्यूशन चित्र उपलब्ध कराबै छै । ई विधि स॑ ट्यूमर टी कोशिका म॑ १-मिथाइलनिकोटिनामाइड (MNA) केरऽ स्तर म॑ काफी वृद्धि के पता चललै, आरू इन विट्रो प्रयोगऽ स॑ पता चललै कि टी कोशिका केरऽ कार्य प॑ एमएनए केरऽ इम्यूनोमोड्यूलेटरी प्रभाव पहिने अज्ञात छेलै । सामान्यतया, ई विधि ट्यूमर आरू प्रतिरक्षा कोशिका के बीच आपसी चयापचय अंतःक्रिया के खुलासा करै छै, आरू प्रतिरक्षा नियमन चयापचय के बारे म॑ अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करै छै, जे टी कोशिका आधारित अंडाशय कैंसर प्रतिरक्षा चिकित्सा उपचार के अवसर के इलाज लेली उपयोगी होय सकै छै.
हमनें एक साथ ग्लूकोज अवशोषण [2-(एन-(7-नाइट्रोफेनिल-2-ऑक्सा-1,3-डायजा-4-इल)एमिनो) -2-डिऑक्सीग्लूकोज (2-एनबीडीजी) आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि [MitoTracker डीप रेड (एमटी डीआर)] (7, 19, 20) एक साथ-साथ विशिष्ट छै मार्कर जे प्रतिरक्षा कोशिका आ ट्यूमर कोशिका आबादी (तालिका S2 आ चित्र S1A) कें भेद करय छै. ई विश्लेषण स॑ पता चललै कि टी कोशिका के तुलना म॑ जलन आरू ट्यूमर कोशिका म॑ ग्लूकोज के अवशोषण के स्तर अधिक होय छै, लेकिन माइटोकॉन्ड्रिया के गतिविधि म॑ छोटऽ अंतर होय छै । ट्यूमर कोशिका [CD45-EpCAM (EpCAM)+] केरऽ औसत ग्लूकोज अवशोषण टी कोशिका केरऽ तीन स॑ चार गुना होय छै, आरू सीडी 4 + टी कोशिका केरऽ औसत ग्लूकोज अवशोषण सीडी 8 + टी कोशिका केरऽ 1.2 गुना होय छै, जे ई दर्शाबै छै कि ट्यूमर घुसपैठ करै वाला लिम्फोसाइट्स (TIL) केरऽ एक ही TME म॑ भी अलग-अलग चयापचय केरऽ आवश्यकता होय छै (चित्र 1A) । एकरऽ विपरीत, ट्यूमर कोशिका म॑ माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि सीडी ४ + टी कोशिका के समान होय ​​छै, आरू दोनों प्रकार के कोशिका के माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि सीडी ८ + टी कोशिका के तुलना म॑ अधिक होय छै (चित्र १ बी) । सामान्यतया, ई परिणाम मेटाबोलिक स्तर के खुलासा करै छै. ट्यूमर कोशिका केरऽ चयापचय गतिविधि सीडी ४ + टी कोशिका केरऽ तुलना म॑ अधिक होय छै, आरू सीडी ४ + टी कोशिका केरऽ चयापचय गतिविधि सीडी ८ + टी कोशिका केरऽ तुलना म॑ अधिक होय छै । कोशिका प्रकार भर म॑ ई प्रभावऽ के बावजूद, ट्यूमर के तुलना म॑ जलन म॑ सीडी ४ + आरू सीडी ८ + टी कोशिका केरऽ चयापचय केरऽ स्थिति या ओकरऽ सापेक्षिक अनुपात म॑ कोनो लगातार अंतर नै छै (चित्र १ सी) । एकरऽ विपरीत, सीडी 45-कोशिका अंश म॑ ट्यूमर म॑ EpCAM+ कोशिका केरऽ अनुपात जलन के तुलना म॑ बढ़ी गेलऽ छेलै (चित्र 1D) । हमनें EpCAM + आरू EpCAM- कोशिका घटक के बीच एक स्पष्ट चयापचय अंतर भी देखलकै । EpCAM+ (ट्यूमर) कोशिका म॑ EpCAM- कोशिका के तुलना म॑ ग्लूकोज के अवशोषण आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि अधिक होय छै, जे टीएमई म॑ ट्यूमर कोशिका म॑ फाइब्रोब्लास्ट के चयापचय गतिविधि स॑ बहुत अधिक होय छै (चित्र 1, ई आरू एफ) ।
(ए आरू बी) जलन आरू ट्यूमर स॑ सीडी 4 + टी कोशिका (MitoTracker गहरे लाल) (MitoTracker गहरे लाल) के ग्लूकोज अवशोषण (2-NBDG) (A) आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि केरऽ माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) (B) प्रतिनिधि ग्राफ (बाएं) आरू सारणीबद्ध आँकड़ा (दाएं), CD8 + टी कोशिका आरू EpCAM + CD45-ट्यूमर कोशिका । (C) जलन एवं ट्यूमर में सीडी 4 + एवं सीडी 8 + कोशिकाओं (सीडी 3 + टी कोशिकाओं के) का अनुपात | (D) जलन एवं ट्यूमर (CD45−) में EpCAM + ट्यूमर कोशिकाओं का अनुपात | (ई आरू एफ) EpCAM + CD45-ट्यूमर आरू EpCAM-CD45-मैट्रिक्स ग्लूकोज अपटेक (2-NBDG) (ई) आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि (MitoTracker डार्क रेड) (F) प्रतिनिधि ग्राफ (बाएं) आरू सारणीबद्ध डाटा ( दाहिना) जलन आरू ट्यूमर कोशिका. (G) फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सीडी25, सीडी137 एवं पीडी1 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि ग्राफ | (एच आरू आई) सीडी 4 + टी कोशिका (एच) आरू सीडी 8 + टी कोशिका (आई) पर सीडी 25, सीडी 137 आरू पीडी 1 अभिव्यक्ति | (J आरू K) CCR7 आरू CD45RO केरऽ अभिव्यक्ति प॑ आधारित भोला, केंद्रीय स्मृति (Tcm), प्रभावक (Teff) आरू प्रभावक स्मृति (Tem) फेनोटाइप । जलन आ ट्यूमर मे सीडी 4 + टी कोशिका (जे) आ सीडी 8 + टी कोशिका (के) के प्रतिनिधि छवि (बाएं) आ सारणीबद्ध आंकड़ा (दाहिना)। युग्मित टी-परीक्षण (* पी <0.05, ** पी <0.01 और *** पी <0.001) द्वारा निर्धारित पी मान | रेखा मिलान रोगी (n = 6) कें प्रतिनिधित्व करय छै. एफएमओ, प्रतिदीप्ति माइनस एक; एमएफआई, माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता।
आगू के विश्लेषण स॑ उच्च रिजोल्यूशन टी सेल फेनोटाइपिक स्टेटस के बीच अन्य महत्वपूर्ण अंतर के पता चललै । ट्यूमर म॑ सक्रिय (चित्र १, जी स॑ आई) आरू प्रभावक स्मृति (चित्र १, जे आरू के) जलन (सीडी 3 + टी कोशिका केरऽ अनुपात) स॑ बहुत अधिक होय छै । इसी तरह, सक्रियण मार्कर (CD25 आरू CD137) आरू डिप्लीशन मार्कर [प्रोग्रामेड सेल डेथ प्रोटीन 1 (PD1)] के अभिव्यक्ति द्वारा फेनोटाइप के विश्लेषण स॑ पता चललै कि यद्यपि ई आबादी केरऽ चयापचय विशेषता अलग-अलग छै (चित्र S1, B स॑ E) , लेकिन भोला, प्रभावक या स्मृति उपसमूह (चित्र S1, F स॑ I) के बीच लगातार कोनों महत्वपूर्ण चयापचय अंतर नै देखलऽ गेलऽ छेलै । ई परिणामऽ के पुष्टि मशीन लर्निंग विधि के उपयोग करी क॑ स्वचालित रूप स॑ कोशिका फेनोटाइप (21) क॑ असाइन करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै, जेकरा स॑ आरू पता चललै कि रोगी केरऽ जलन (चित्र S2A) म॑ अस्थि मज्जा कोशिका (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) केरऽ बड़ी संख्या म॑ मौजूदगी । सब पहचानलऽ गेलऽ कोशिका प्रकारऽ म॑ स॑ ई माइलोइड कोशिका आबादी न॑ सबसें अधिक ग्लूकोज अवशोषण आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि देखैलकै (चित्र S2, B स॑ G) । ई परिणाम एचजीएससी मरीजऽ म॑ जलन आरू ट्यूमर म॑ मिलै वाला कई कोशिका प्रकार के बीच मजबूत चयापचय अंतर क॑ उजागर करै छै ।
टीआईएल केरऽ मेटाबोनोमिक विशेषता क॑ समझै म॑ मुख्य चुनौती ट्यूमर स॑ पर्याप्त शुद्धता, गुणवत्ता आरू मात्रा के टी सेल नमूना क॑ अलग करै के जरूरत छै । हाल के अध्ययन स॑ पता चललै छै कि फ्लो साइटोमेट्री प॑ आधारित छँटाई आरू बीड संवर्धन विधि स॑ कोशिकीय मेटाबोलाइट प्रोफाइल म॑ बदलाव आबी सकै छै ( 22-24 ). ई समस्या स॑ उबर॑ लेली, हमन॑ एलसी-एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण स॑ पहल॑ शल्य चिकित्सा द्वारा रिसेक्ट करलऽ गेलऽ मानव अंडाशय कैंसर स॑ टीआईएल क॑ अलग करै आरू अलग करै लेली बीड संवर्धन विधि क॑ अनुकूलित करलकै (देखऽ सामग्री आरू विधि; चित्र 2 ए) । मेटाबोलाइट परिवर्तन प॑ ई प्रोटोकॉल केरऽ समग्र प्रभाव के आकलन करै लेली, हमन॑ उपरोक्त बीड पृथक्करण चरण के बाद स्वस्थ दाता द्वारा सक्रिय करलऽ गेलऽ टी कोशिका के मेटाबोलाइट प्रोफाइल के तुलना ऐन्हऽ कोशिका स॑ करलकै जे बीड अलग नै छेलै लेकिन बर्फ प॑ ही रह॑ छेलै । ई गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण स॑ पता चललै कि ई दूनू शर्तऽ के बीच उच्च सहसंबंध छै (r = 0.77), आरू 86 मेटाबोलाइट्स केरऽ समूह केरऽ तकनीकी पुनरावृत्ति क्षमता म॑ उच्च पुनरावृत्ति क्षमता छै (चित्र 2B) । अतः ई विधि कोशिका प्रकार संवर्धन स॑ गुजर रहलऽ कोशिका म॑ सटीक मेटाबोलाइट विश्लेषण करी सकै छै, जेकरा स॑ एचजीएससी म॑ विशिष्ट मेटाबोलाइट्स के पहचान करै लेली पहलऽ उच्च रिजोल्यूशन वाला मंच उपलब्ध होय सकै छै, जेकरा स॑ लोगऽ क॑ कोशिका विशिष्टता के गहन समझ प्राप्त करै म॑ सक्षम होय जाय छै यौन चयापचय कार्यक्रम ।
(A) चुंबकीय मनका संवर्धन के योजनाबद्ध आरेख। एलसी-एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण स॑ पहल॑ कोशिका लगातार तीन दौर के चुंबकीय बीड संवर्धन स॑ गुजरतै या बर्फ प॑ रहतै । (B) मेटाबोलाइट्स के प्रचुरता पर संवर्धन प्रकार का प्रभाव | प्रत्येक संवर्धन प्रकार ± एसई कें लेल तीन मापन कें औसत. धूसर रेखा 1:1 संबंध के प्रतिनिधित्व करै छै. अक्ष लेबल म॑ दिखालऽ गेलऽ बार-बार मापन केरऽ इंट्रा-क्लास सहसंबंध (आईसीसी) । एनएडी, निकोटिनामाइड एडेनिन डाइनुक्लिओटाइड। (C) रोगी मेटाबोलाइट विश्लेषण के कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध आरेख | जलोढ़ या ट्यूमर कें रोगी सं एकत्रित कैल जायत छै आ क्रायोप्रिजर्व कैल जायत छै. प्रत्येक नमूना केरऽ एगो छोटऽ हिस्सा क॑ फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करलऽ गेलऽ छेलै, जबकि शेष नमूना म॑ सीडी ४+, सीडी ८+ आरू सीडी ४५- कोशिका लेली तीन दौर के संवर्धन करलऽ गेलऽ छेलै । ई कोशिका अंशऽ के विश्लेषण एलसी-एमएस/एमएस के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । (D) मानकीकृत चयापचय पदार्थ प्रचुरता के ताप मानचित्र | डेंड्रोग्राम नमूना के बीच यूक्लिडियन दूरी के वार्ड के समूहीकरण के प्रतिनिधित्व करै छै. (ई) नमूना मेटाबोलाइट नक्शा कें प्रधान घटक विश्लेषण (पीसीए), प्रत्येक नमूना कें तीन प्रतिलिपि कें दर्शा रहल छै, एकहि रोगी कें नमूनाक कें एकटा लाइन सं जोड़ल गेल छै. (F) रोगी पर कंडीशनल नमूना कें मेटाबोलाइट प्रोफाइल कें पीसीए (अर्थात, आंशिक अतिरेक कें उपयोग करयत); नमूना प्रकार उत्तल पतवार द्वारा सीमित अछि | पीसी1, मुख्य घटक 1; पीसी2, मुख्य घटक 2।
अगिला, हम छह एचजीएससी रोगी (चित्र 2C, चित्र S3A आ तालिका S3 आ S4) के प्राथमिक जलन आ ट्यूमर में CD4 +, CD8 + आ CD45-कोशिका अंश में 99 मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण करय लेल एहि संवर्धन विधि के लागू केलहुं. ब्याज केरऽ आबादी जीवित कोशिका केरऽ मूल बड़ऽ नमूना केरऽ २% स॑ ७०% होय छै, आरू कोशिका केरऽ अनुपात मरीजऽ के बीच बहुत भिन्न होय ​​छै । बीड्स कें अलग करला कें बाद, ब्याज कें समृद्ध अंश (सीडी4+, सीडी8+ या सीडी45-) औसतन नमूना मे सब जीवित कोशिका कें 85% सं बेसि कें हिस्सा छै. ई संवर्धन विधि हमरा सब क॑ मानव ट्यूमर ऊतक चयापचय स॑ कोशिका आबादी के विश्लेषण करै के अनुमति दै छै, जे बड़ऽ नमूना स॑ करना असंभव छै । ई प्रोटोकॉल के उपयोग करी क॑ हमन॑ ई निर्धारित करलकै कि एल-काइनुरेनिन आरू एडेनोसाइने, ई दूनू अच्छा तरह स॑ विशेषता वाला इम्यूनोसप्रेसिव मेटाबोलाइट्स ट्यूमर टी कोशिका या ट्यूमर कोशिका म॑ ऊंचा होय गेलऽ छेलै (चित्र S3, B आरू C) । अतः ई परिणाम हमरऽ कोशिका पृथक्करण आरू मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक केरऽ निष्ठा आरू क्षमता क॑ दर्शाबै छै कि रोगी के ऊतकऽ म॑ जैविक रूप स॑ महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स खोजै छै ।
हमरऽ विश्लेषण स॑ भी मरीजऽ के भीतर आरू बीच कोशिका प्रकार केरऽ मजबूत चयापचय पृथक्करण के पता चललै (चित्र 2D आरू चित्र S4A) । विशेष रूप सं, अन्य रोगी कें तुलना मे, रोगी 70 मे अलग-अलग चयापचय विशेषता (चित्र 2E आ चित्र S4B) देखल गेलय, जे इ दर्शाबैत छै कि रोगी कें बीच पर्याप्त चयापचय विषमता भ सकय छै. ध्यान देबऽ के बात छै कि अन्य रोगी (1.2 स॑ 2 लीटर; तालिका S1) के तुलना म॑, रोगी 70 (80 मिलीलीटर) म॑ एकत्रित जलन के कुल मात्रा कम छेलै । प्रधान घटक विश्लेषण के दौरान अंतर-रोगी विषमता के नियंत्रण (उदाहरण के लेल, आंशिक अतिरेक विश्लेषण के उपयोग सं) कोशिका प्रकार के बीच लगातार परिवर्तन दर्शाबै छै, आरू कोशिका प्रकार आरू/या सूक्ष्म वातावरण मेटाबोलाइट प्रोफाइल के अनुसार स्पष्ट रूप स॑ एकत्रित करलऽ जाय छै (चित्र 2F) । एकल मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण स॑ ई प्रभावऽ प॑ जोर देलऽ गेलै आरू कोशिका के प्रकार आरू सूक्ष्म वातावरण के बीच महत्वपूर्ण अंतर के पता चललै । ध्यान देबऽ के बात छै कि सबसें चरम अंतर देखलऽ जाय वाला एमएनए छै, जे आमतौर पर सीडी ४५- कोशिका आरू सीडी ४+ आरू सीडी ८+ कोशिका म॑ समृद्ध होय छै जे ट्यूमर म॑ घुसपैठ करै छै (चित्र ३ ए) । सीडी 4 + कोशिका के लेल ई प्रभाव सबस बेसी स्पष्ट अछि, आ सीडी 8 + कोशिका में एमएनए सेहो पर्यावरण स बेसी प्रभावित बुझाइत अछि । मुदा, ई महत्वपूर्ण नहिं, कारण, छह रोगी में सं मात्र तीन गोटेक ट्यूमर सीडी 8+ स्कोरक मूल्यांकन कयल जा सकैत अछि. एमएनए के अलावा, जलन आरू ट्यूमर म॑ विभिन्न प्रकार के कोशिका म॑, अन्य मेटाबोलाइट्स जे टीआईएल म॑ खराब विशेषता वाला छै, भी अंतर स॑ समृद्ध होय छै (चित्र S3 आरू S4) । अतः ई आंकड़ा आगू के शोध लेली इम्यूनोमोड्यूलेटरी मेटाबोलाइट्स केरऽ एगो आशाजनक सेट के खुलासा करै छै ।
(A) जलन एवं ट्यूमर से सीडी 4+, सीडी 8+ एवं सीडी 45- कोशिकाओं में एमएनए की सामान्य सामग्री | बॉक्स प्लॉट मे मीडियन (लाइन), इंटरक्वार्टाइल रेंज (फ्रेम काज) आ डाटा रेंज कें दर्शाओल गेल छै, जे इंटरक्वार्टाइल रेंज (फ्रेम व्हिस्कर) कें 1.5 गुना तइक छै. जैना की रोगी सामग्री आ विधियक मे वर्णित छै, पी मान (*P<0.05 आ **P<0.01) कें निर्धारित करय कें लेल रोगी कें लिम्मा मान कें उपयोग करूं. (B) एमएनए चयापचय के योजनाबद्ध आरेख (60)। चयापचय पदार्थ: एस-एडेनोसाइल-1-मेथियोनिन; एसएएच, एस-एडेनोसिन-1-होमोसिस्टीन; एनए, निकोटिनामाइड; एमएनए, 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड; 2-पीवाई, 1-मिथाइल- 2-पिरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड; 4-पीवाई, 1-मिथाइल-4-पिरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड; एन आर, निकोटिनामाइड राइबोज; एनएमएन, निकोटिनामाइड मोनोन्यूक्लिओटाइड। एंजाइम (हरे): एनएनएमटी, निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़; SIRT, सिर्टुइन, आर। NAMPT, निकोटिनामाइड फॉस्फोरिबोसाइल ट्रांसफरेज़; AOX1, एल्डीहाइड ऑक्सीडेज 1; एनआरके, निकोटिनामाइड राइबोसाइड किनेज़; एनएमएनएटी, निकोटिनामाइड मोनो न्यूक्लियोटाइड एडेनिलेट ट्रांसफरेज़; Pnp1, प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज। (सी) जलन (ग्रे) और ट्यूमर (लाल; n = 3 रोगी) के scRNA-seq के टी-SNE | (D) scRNA-seq के उपयोग स॑ पहचानलऽ गेलऽ विभिन्न कोशिका आबादी म॑ एनएनएमटी अभिव्यक्ति । (ई) एसके-ओवी-3, मानव भ्रूण गुर्दे (एचईके) 293टी, टी कोशिकाओं एवं एमएनए-उपचारित टी कोशिकाओं में एनएनएमटी एवं एओएक्स1 की अभिव्यक्ति | मुड़ा अभिव्यक्ति एसके-ओवी-3 के सापेक्ष दिखाया गया है | एसईएम कें साथ अभिव्यक्ति पैटर्न दिखायल गेल छै (n = 6 स्वस्थ दाता)। 35 सं बेसि Ct मान कें अज्ञात (UD) मानल जायत छै. (F) 8mM MNA के साथ उपचारित SK-OV-3, HEK293T, टी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं में SLC22A1 और SLC22A2 की अभिव्यक्ति | मुड़ा अभिव्यक्ति एसके-ओवी-3 के सापेक्ष दिखाया गया है | एसईएम कें साथ अभिव्यक्ति पैटर्न दिखायल गेल छै (n = 6 स्वस्थ दाता)। 35 सं बेसि Ct मान कें अज्ञात (UD) मानल जायत छै. (G) एमएनए के साथ 72 घंटे ऊष्मायन के बाद सक्रिय स्वस्थ दाता टी कोशिकाओं में कोशिका एमएनए सामग्री | एसईएम कें साथ अभिव्यक्ति पैटर्न दिखायल गेल छै (n = 4 स्वस्थ दाता)।
एमएनए केरऽ उत्पादन निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़ (एनएनएमटी; चित्र 3 बी) द्वारा एस-एडेनोसाइल-1-मेथियोनिन (एसएएम) स॑ निकोटिनामाइड (एनए) म॑ मिथाइल समूह क॑ स्थानांतरित करी क॑ करलऽ जाय छै । एनएनएमटी मानव कैंसर केरऽ विभिन्न प्रकार म॑ अधिक अभिव्यक्त होय छै आरू प्रसार, आक्रमण आरू मेटास्टेसिस (25-27) स॑ जुड़लऽ छै । टीएमई म॑ टी कोशिका म॑ एमएनए के स्रोत क॑ बेहतर ढंग स॑ समझै लेली, हमन॑ तीन एचजीएससी मरीजऽ के जलन आरू ट्यूमर म॑ कोशिका प्रकार भर म॑ एनएनएमटी के अभिव्यक्ति के विशेषता बताबै लेली scRNA-seq के प्रयोग करलकै (तालिका S5) । लगभग 6,500 कोशिका के विश्लेषण स॑ पता चललै कि जलन आरू ट्यूमर वातावरण म॑ एनएनएमटी अभिव्यक्ति अनुमानित फाइब्रोब्लास्ट आरू ट्यूमर कोशिका आबादी तलक सीमित छेलै (चित्र 3, सी आरू डी) । ध्यान देबऽ वाला बात छै कि पीटीपीआरसी (सीडी45 +) (चित्र 3D आरू चित्र S5A) क॑ व्यक्त करै वाला कोनों भी आबादी म॑ एनएनएमटी अभिव्यक्ति केरऽ स्पष्ट अभिव्यक्ति नै छै, जे ई दर्शाबै छै कि मेटाबोलाइट स्पेक्ट्रम म॑ पता चललऽ एमएनए क॑ टी कोशिका म॑ पेश करलऽ गेलऽ छै । एल्डीहाइड ऑक्सीडेज 1 (AOX1) केरऽ अभिव्यक्ति एमएनए क॑ 1-मिथाइल-2-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (2-PYR) या 1-मिथाइल-4-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (4- PYR) म॑ बदलै छै; चित्र 3B) COL1A1 (चित्र S5A) क॑ व्यक्त करै वाला फाइब्रोब्लास्ट केरऽ आबादी तलक भी सीमित छै, जे मिल क॑ ई दर्शाबै छै कि टी कोशिका म॑ पारंपरिक एमएनए चयापचय के क्षमता के कमी छै । इन एमएनए-संबंधित जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न क॑ एचजीएससी मरीजऽ स॑ जलन स॑ एक दूसरऽ स्वतंत्र कोशिका डाटा सेट के उपयोग करी क॑ सत्यापन करलऽ गेलऽ छेलै (चित्र S5B; n = 6) (16) । एकरऽ अलावा, एमएनए स॑ उपचारित स्वस्थ दाता टी कोशिका केरऽ मात्रात्मक पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) विश्लेषण स॑ पता चललै कि नियंत्रण एसके-ओवी-3 अंडाशय ट्यूमर कोशिका के तुलना म॑ एनएनएमटी या एओएक्स१ लगभग व्यक्त नै करलऽ गेलऽ छेलै (चित्र 3E) । ई अप्रत्याशित परिणाम संकेत करै छै कि एमएनए फाइब्रोब्लास्ट या ट्यूमर स॑ टीएमई म॑ सटल टी कोशिका म॑ स्रावित होय सकै छै ।
यद्यपि उम्मीदवारऽ म॑ घुलनशील वाहक 22 (SLC22) परिवार (SLC22A1, SLC22A2 आरू SLC22A3) द्वारा एन्कोड करलऽ गेलऽ कार्बनिक कटियन ट्रांसपोर्टर 1 स॑ 3 (OCT1, OCT2 आरू OCT3) केरऽ परिवार शामिल छै, लेकिन एमएनए केरऽ संभावित ट्रांसपोर्टर अखनी तलक अपरिभाषित छै (28) । स्वस्थ दाता टी कोशिका स॑ mRNA केरऽ QPCR न॑ SLC22A1 केरऽ कम अभिव्यक्ति स्तर लेकिन SLC22A2 केरऽ अज्ञात स्तर देखैलकै, जेकरा स॑ ई बात के पुष्टि होय गेलै कि एकरा साहित्य म॑ पहल॑ भी रिपोर्ट करलऽ गेलऽ छेलै (चित्र 3F) (29) । एकरऽ विपरीत, एसके-ओवी-3 अंडाशय ट्यूमर कोशिका रेखा न॑ दूनू ट्रांसपोर्टर केरऽ उच्च स्तर व्यक्त करलकै (चित्र 3F) ।
टी कोशिका म॑ विदेशी एमएनए क॑ अवशोषित करै के क्षमता के संभावना के परीक्षण करै लेली स्वस्थ दाता टी कोशिका क॑ एमएनए केरऽ अलग-अलग सांद्रता के उपस्थिति म॑ ७२ घंटा तलक संवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै । बहिर्जात एमएनए के अभाव मे एमएनए के कोशिकीय सामग्री के पता नहि लगाओल जा सकैत अछि (चित्र 3जी) । लेकिन, बहिर्जात एमएनए स॑ उपचारित सक्रिय टी कोशिका न॑ कोशिका म॑ एमएनए सामग्री म॑ खुराक-निर्भर वृद्धि देखैलकै, जे 6 एमएम एमएनए तलक (चित्र 3 जी) । ई परिणाम संकेत करै छै कि ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति केरऽ कम स्तर आरू अंतःकोशिकीय एमएनए चयापचय लेली जिम्मेदार मुख्य एंजाइम के कमी के बावजूद, टीआईएल अखनी भी एमएनए क॑ ग्रहण करी सकै छै ।
रोगी केरऽ टी कोशिका म॑ मेटाबोलाइट्स केरऽ स्पेक्ट्रम आरू इन विट्रो एमएनए अवशोषण प्रयोग स॑ ई संभावना बढ़ी जाय छै कि कैंसर स॑ जुड़लऽ फाइब्रोब्लास्ट (CAF) एमएनए के स्राव करै छै आरू ट्यूमर कोशिका टीआईएल केरऽ फेनोटाइप आरू कार्य क॑ नियंत्रित करी सकै छै । टी कोशिका प॑ एमएनए केरऽ प्रभाव क॑ निर्धारित करै लेली, स्वस्थ दाता टी कोशिका क॑ एमएनए केरऽ उपस्थिति या अनुपस्थिति म॑ इन विट्रो म॑ सक्रिय करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरऽ प्रसार आरू साइटोकिन उत्पादन के मूल्यांकन करलऽ गेलऽ छेलै । सबसँ बेसी खुराक मे एमएनए जोड़लाक 7 दिनक बाद जनसंख्या दोगुना संख्या मे मध्यम कमी आयल, जखन कि सब खुराक मे जोश बनल रहल (चित्र 4 ए) । एकरऽ अलावा, बहिर्जात एमएनए केरऽ उपचार के परिणामस्वरूप ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (TNFα; चित्र 4B) क॑ व्यक्त करै वाला सीडी 4 + आरू सीडी 8 + टी कोशिका केरऽ अनुपात म॑ वृद्धि होय गेलै । एकरऽ विपरीत, सीडी 4 + टी कोशिका म॑ IFN-γ केरऽ अंतःकोशिकीय उत्पादन म॑ काफी कमी आबी गेलऽ छेलै, लेकिन सीडी 8 + टी कोशिका म॑ नै, आरू इंटरल्यूकिन 2 (आईएल-2; चित्र 4, सी आरू डी) म॑ कोनों महत्वपूर्ण परिवर्तन नै देखलऽ गेलऽ छेलै । अतः, ई एमएनए-उपचारित टी कोशिका संस्कृतियऽ स॑ सुपरनेटेंट केरऽ एंजाइम-लिंक इम्यूनोसॉर्बेंट परख (ELISA) न॑ TNFα म॑ काफी वृद्धि, IFN-γ म॑ कमी, आरू आईएल-2 म॑ कोनो बदलाव नै देखैलकै (चित्र 4, ई स॑ जी) । . IFN-γ केरऽ कमी संकेत करै छै कि एमएनए टी कोशिका केरऽ एंटी-ट्यूमर गतिविधि क॑ रोकै म॑ भूमिका निभा सकै छै । टी कोशिका-मध्यस्थता वाला साइटोटोक्सिसिटी प॑ एमएनए केरऽ प्रभाव के अनुकरण करै लेली, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) -CAR-T) कोशिका द्वारा विनियमित फोलेट रिसेप्टर α आरू सीएआर-टी (GFP) क॑ लक्षित करै वाला काइमेरियल एंटीजन रिसेप्टर टी (FRα-CAR-T) कोशिका क॑ स्वस्थ दाता परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिका (PBMC) द्वारा उत्पादित करलऽ जाय छै । सीएआर-टी कोशिका क॑ एमएनए केरऽ उपस्थिति म॑ 24 घंटा तलक संवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद मानव एसके-ओवी-3 अंडाशय ट्यूमर कोशिका के साथ सह-संवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै जे फोलेट रिसेप्टर α क॑ 10:1 के प्रभावक आरू लक्ष्य अनुपात प॑ व्यक्त करै छै । एमएनए उपचार के परिणामस्वरूप FRα-CAR-T कोशिका के हत्या गतिविधि म॑ काफी कमी आबी गेलै, जे एडेनोसाइने स॑ उपचारित FRα-CAR-T कोशिका के समान छेलै (चित्र 4H) ।
(A) कुल व्यवहार्य कोशिका गिनती आ जनसंख्या दोगुना (पीडी) सीधा दिन 7 पर संस्कृति सं.बार ग्राफ छह स्वस्थ दाताक कें औसत + एसईएम कें प्रतिनिधित्व करयत छै. कम स कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोग स डेटा क प्रतिनिधित्व करैत अछि। (B to D) CD3/CD28 आरू IL-2 के उपयोग टी कोशिका क॑ अपनऽ-अपनऽ एमएनए सांद्रता प॑ 7 दिन तलक सक्रिय करै लेली करलऽ गेलऽ छेलै । विश्लेषण स॑ पहल॑ कोशिका क॑ गोल्गीस्टॉप के साथ पीएमए/आयनोमाइसिन स॑ ४ घंटा तलक उत्तेजित करलऽ गेलऽ छेलै । टी कोशिकाओं में TNFα (बी) अभिव्यक्ति। जीवित कोशिकाओं म॑ TNFα अभिव्यक्ति केरऽ उदाहरण छवि (बाँया) आरू सारणीबद्ध आँकड़ा (दाएं) । टी कोशिकाओं में IFN-γ (C) और IL-2 (D) अभिव्यक्ति | साइटोकाइन्स केरऽ अभिव्यक्ति क॑ फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापलऽ गेलऽ छेलै । बार ग्राफ औसत (n = 6 स्वस्थ दाता) + एसईएम कें प्रतिनिधित्व करयत छै. पी मान कें निर्धारण करय कें लेल विचरण कें एकतरफा विश्लेषण आ दोहरायल गेलय माप (*P<0.05 आ **P<0.01) कें उपयोग करय. कम स कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोग स डेटा क प्रतिनिधित्व करैत अछि। (ई स॑ जी) सीडी 3/सीडी28 आरू आईएल-2 के उपयोग टी कोशिका क॑ अपनऽ-अपनऽ एमएनए सांद्रता प॑ 7 दिन तलक सक्रिय करै लेली करलऽ गेलऽ छेलै । पीएमए/आयनोमाइसिन उत्तेजना कें 4 घंटा सं पहिले आ बाद मे माध्यम एकत्र कैल गेलय. TNFα (E), IFN-γ (F) आरू IL-2 (G) केरऽ सांद्रता क॑ एलिसा द्वारा मापलऽ गेलऽ छेलै । बार ग्राफ औसत (n = 5 स्वस्थ दाता) + एसईएम कें प्रतिनिधित्व करयत छै. विचरण के एकतरफा विश्लेषण आरू दोहराया गेलऽ मापन (* पी <0.05) के उपयोग स॑ निर्धारित पी मान । बिंदीदार रेखा पता लगाबै के सीमा के इंगित करै छै. (ज) कोशिका लाइसिस परख। FRα-CAR-T या GFP-CAR-T कोशिका क॑ एडेनोसाइने (250μM) या MNA (10 mM) स॑ 24 घंटा तलक समायोजित करलऽ गेलऽ छेलै, या बिना उपचारित (Ctrl) छोड़लऽ गेलऽ छेलै । एसके-ओवी-3 कोशिका के प्रतिशत हत्या के मापल गेल। वेल्च टी परीक्षण (* पी <0.5 और ** पी <0.01) द्वारा निर्धारित पी मान |
एमएनए-निर्भर TNFα अभिव्यक्ति विनियमन केरऽ यंत्रवत समझ प्राप्त करै लेली, एमएनए-उपचारित टी कोशिका केरऽ TNFα mRNA म॑ ​​परिवर्तन के मूल्यांकन करलऽ गेलऽ छेलै (चित्र 5 ए) । एमएनए स॑ उपचारित स्वस्थ दाता टी कोशिका न॑ TNFα ट्रांसक्रिप्शन लेवल म॑ दू गुना वृद्धि देखैलकै, जे ई दर्शाबै छै कि एमएनए TNFα ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन प॑ निर्भर छै । ई संभावित नियामक तंत्र के जांच करै लेली, दू ज्ञात प्रतिलेखन कारक जे TNFα क॑ नियंत्रित करै छै, अर्थात सक्रिय टी सेल न्यूक्लियर फैक्टर (NFAT) आरू विशिष्ट प्रोटीन 1 (Sp1), क॑ समीपस्थ TNFα प्रमोटर ( 30 ) क॑ एमएनए बाइंडिंग के प्रतिक्रिया म॑ मूल्यांकन करलऽ गेलऽ छेलै । TNFα प्रोमोटर म॑ 6 पहचानलऽ गेलऽ NFAT बाइंडिंग साइट आरू 2 Sp1 बाइंडिंग साइट होय छै, जे एक साइट प॑ ओवरलैप होय छै [5'cap स॑ -55 बेस जोड़ी (bp)] (30) । क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसिपिटेशन (ChIP) न॑ देखैलकै कि जब॑ एमएनए स॑ उपचार करलऽ गेलै त॑ Sp1 केरऽ TNFα प्रोमोटर स॑ जुड़ाव तीन गुना बढ़ी गेलै । एनएफएटी कें समावेश मे सेहो वृद्धि भेल आ महत्व कें नजदीक आबि गेल (चित्र 5 बी)। ई आंकड़ा संकेत करै छै कि एमएनए Sp1 ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम स॑ TNFα के अभिव्यक्ति क॑ नियंत्रित करै छै, आरू कम हद तलक NFAT केरऽ अभिव्यक्ति क॑ नियंत्रित करै छै ।
(ए) एमएनए के बिना संवर्धित टी कोशिकाओं के साथ तुलना में, एमएनए के साथ उपचारित टी कोशिकाओं में TNFα अभिव्यक्ति के गुना परिवर्तन | एसईएम कें साथ अभिव्यक्ति पैटर्न दिखायल गेल छै (n = 5 स्वस्थ दाता)। कम स कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोग स डेटा क प्रतिनिधित्व करैत अछि। (B) NFAT आरू Sp1 के बाद 8 mM MNA के साथ या बिना उपचारित टी कोशिका के TNFα प्रोमोटर क॑ (Ctrl) आरू PMA/ionomycin उत्तेजना स॑ 4 घंटा तलक संयोजित करलऽ गेलऽ छेलै । इम्यूनोग्लोबुलिन जी (IgG) आरू एच 3 क॑ क्रमशः इम्यूनोप्रेसिपिटेशन लेली नकारात्मक आरू सकारात्मक नियंत्रण के रूप म॑ प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । चिप केरऽ मात्रा निर्धारण स॑ पता चललै कि एमएनए-उपचारित कोशिका म॑ TNFα प्रोमोटर स॑ Sp1 आरू NFAT केरऽ बाइंडिंग नियंत्रण के तुलना म॑ कई गुना बढ़ी गेलऽ छै । कम स कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोग स डेटा क प्रतिनिधित्व करैत अछि। कई टी-परीक्षण (*** पी <0.01) द्वारा निर्धारित पी मान। (C) एचजीएससी केरऽ जलन के तुलना म॑ टी कोशिका (गैर-साइटोटोक्सिक) न॑ ट्यूमर म॑ टीएनएफ केरऽ अभिव्यक्ति म॑ वृद्धि देखैलकै । रंग अलग-अलग मरीज के प्रतिनिधित्व करैत अछि। प्रदर्शित कोशिका क॑ यादृच्छिक रूप स॑ 300 तलक नमूना लेलऽ गेलऽ छै आरू ओवरड्राइंग (** Padj = 0.0076) क॑ सीमित करै लेली जिटर करलऽ गेलऽ छै । (D) अंडाशय कैंसर के लिये एमएनए का प्रस्तावित मॉडल | एमएनए ट्यूमर कोशिका आरू टीएमई म॑ फाइब्रोब्लास्ट म॑ पैदा होय छै आरू टी कोशिका द्वारा ग्रहण करलऽ जाय छै । एमएनए TNFα प्रोमोटर स॑ Sp1 केरऽ बाइंडिंग क॑ बढ़ाबै छै, जेकरा स॑ TNFα ट्रांसक्रिप्शन आरू TNFα साइटोकिन उत्पादन म॑ वृद्धि होय छै । एमएनए के कारण IFN-γ में भी कमी आबै छै । टी सेल केरऽ कार्य म॑ रोकथाम स॑ मारय के क्षमता म॑ कमी ​​आरू ट्यूमर केरऽ विकास म॑ तेजी आबै छै ।
रिपोर्ट के अनुसार, TNFα के सामने आरू पीठ पर निर्भर एंटी-ट्यूमर आरू एंटी-ट्यूमर प्रभाव छै, लेकिन अंडाशय के कैंसर के विकास आरू मेटास्टेसिस क॑ बढ़ावा दै म॑ एकरऽ सुप्रसिद्ध भूमिका छै ( 31-33 ). रिपोर्ट के अनुसार, अंडाशय के कैंसर के मरीज में जलन आ ट्यूमर के ऊतक में TNFα के सांद्रता सौम्य ऊतक के तुलना में अधिक छै ( 34-36 ). तंत्र के संदर्भ म॑, TNFα श्वेत रक्त कोशिका केरऽ सक्रियण, कार्य आरू प्रसार क॑ नियंत्रित करी सकै छै, आरू कैंसर कोशिका केरऽ फेनोटाइप क॑ बदली सकै छै ( 37 , 38 ). ई निष्कर्षऽ के अनुरूप, विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण स॑ पता चललै कि जलन (चित्र 5C) के तुलना म॑ ट्यूमर ऊतकऽ म॑ टी कोशिका म॑ टीएनएफ काफी अप-रेगुलेट होय गेलऽ छेलै । टीएनएफ अभिव्यक्ति म॑ वृद्धि केवल गैर-साइटोटोक्सिक फेनोटाइप (चित्र S5A) वाला टी कोशिका आबादी म॑ ही स्पष्ट छेलै । संक्षेप म॑ कहलऽ जाय त॑ ई आंकड़ा ई विचार के समर्थन करै छै कि एमएनए केरऽ एचजीएससी म॑ दोहरी इम्यूनोसप्रेसिव आरू ट्यूमर बढ़ावा दै वाला प्रभाव छै ।
फ्लो साइटोमेट्री पर आधारित फ्लोरोसेंट लेबलिंग टीआईएल मेटाबॉलिज्म के अध्ययन के मुख्य तरीका बनि गेल अछि. ई अध्ययनऽ स॑ पता चललै छै कि परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स या माध्यमिक लिम्फोइड अंगऽ स॑ मिललऽ टी कोशिका के तुलना म॑ मूरीन आरू मानव टीआईएल म॑ ग्लूकोज (4, 39) आरू माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ कार्य म॑ धीरे-धीरे नुकसान (19, 40) के अधिक प्रवृत्ति होय छै । हालांकि हमनें ई अध्ययन म॑ भी ऐन्हऽ ही परिणाम देखलऽ छै, लेकिन एकरऽ मुख्य विकास एक ही रिसेक्टेड ट्यूमर ऊतक स॑ ट्यूमर कोशिका आरू टीआईएल केरऽ चयापचय के तुलना करना छै । ई पिछला कुछ रिपोर्टऽ के अनुरूप, जलन आरू ट्यूमर स॑ निकलै वाला ट्यूमर (CD45-EpCAM +) कोशिका म॑ सीडी 8 + आरू सीडी 4 + टी कोशिका के तुलना म॑ ग्लूकोज के अवशोषण अधिक होय छै, जे ई बात के समर्थन करै छै कि ट्यूमर कोशिका के उच्च ग्लूकोज के अवशोषण के तुलना टी कोशिका स॑ करलऽ जाब॑ सकै छै । टी सेल प्रतिस्पर्धा की अवधारणा। टीएमई। लेकिन, ट्यूमर कोशिका केरऽ माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि सीडी ८ + टी कोशिका केरऽ तुलना म॑ अधिक होय छै, लेकिन माइटोकॉन्ड्रिया केरऽ गतिविधि सीडी ४ + टी कोशिका केरऽ समान होय ​​छै । ई परिणाम उभरतऽ विषय क॑ मजबूत करै छै कि ऑक्सीडेटिव मेटाबॉलिज्म ट्यूमर कोशिका ( 41 , 42 ) लेली महत्वपूर्ण छै । हुनकऽ ई भी सुझाव छै कि सीडी 8 + टी कोशिका सीडी 4 + टी कोशिका के तुलना म॑ ऑक्सीडेटिव डिसफंक्शन के प्रति अधिक संवेदनशील होय सकै छै, या सीडी 4 + टी कोशिका माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि क॑ बनाए रखै लेली ग्लूकोज के अलावा कार्बन स्रोत के उपयोग करी सकै छै ( 43 , 44 ). ध्यान देबऽ के बात छै कि हमनें जलन म॑ सीडी ४ + टी इफेक्टर, टी इफेक्टर मेमोरी आरू टी सेंट्रल मेमोरी कोशिका के बीच ग्लूकोज के अवशोषण या माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि म॑ कोनो अंतर नै देखलऽ गेलै । तहिना, ट्यूमर म॑ सीडी 8 + टी कोशिका केरऽ भेदभाव अवस्था केरऽ ग्लूकोज अवशोषण म॑ बदलाव स॑ कोनो संबंध नै छै, जे इन विट्रो म॑ संवर्धित टी कोशिका आरू इन विवो म॑ मानव टीआईएल के बीच महत्वपूर्ण अंतर क॑ उजागर करै छै ( 22 ). ई अवलोकनऽ के पुष्टि निष्पक्ष स्वचालित कोशिका जनसंख्या आवंटन के उपयोग स॑ भी करलऽ गेलै, जेकरा स॑ आगू पता चललै कि ट्यूमर कोशिका के तुलना म॑ अधिक ग्लूकोज अवशोषण आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि वाला सीडी४५ + / सीडी३- / सीडी ४ + / सीडी४५आरओ + कोशिका प्रचलित छै लेकिन ओकरा म॑ मेटाबोलिक सक्रिय कोशिका आबादी छै । ई आबादी scRNA-seq विश्लेषण म॑ पहचानलऽ गेलऽ माइलोइड सप्रेसर कोशिका या प्लाज्मासाइटोइड डेंड्रिटिक कोशिका केरऽ कथित उपजनसंख्या के प्रतिनिधित्व करी सकै छै । यद्यपि ई दुनू मानव अंडाशय ट्यूमर मे रिपोर्ट कयल गेल अछि [45] , मुदा एखनो एकरा सभक आवश्यकता अछि आओर काज एहि माइलोइड उपजनसंख्याक वर्णन करब अछि ।
हालांकि फ्लो साइटोमेट्री आधारित विधि कोशिका प्रकार के बीच ग्लूकोज आरू ऑक्सीडेटिव चयापचय के सामान्य अंतर क॑ स्पष्ट करी सकै छै, लेकिन टीएमई म॑ माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय लेली ग्लूकोज या अन्य कार्बन स्रोतऽ द्वारा उत्पादित सटीक चयापचय पदार्थ के निर्धारण अभी तलक नै करलऽ गेलऽ छै । कोनों दिअ गेल टीआईएल उपसमूह मे मेटाबोलाइट्स कें उपस्थिति या अनुपस्थिति कें असाइन करय कें लेल निकालल गेल ऊतक सं कोशिका आबादी कें शुद्धिकरण कें आवश्यकता होयत छै. अतः मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिललऽ हमरऽ कोशिका संवर्धन विधि स॑ मरीज के नमूना के मिलान म॑ टी कोशिका आरू ट्यूमर कोशिका के आबादी म॑ अंतर स॑ समृद्ध होय वाला मेटाबोलाइट्स के बारे म॑ जानकारी मिल॑ सकै छै । यद्यपि ई विधि क॑ प्रतिदीप्ति-सक्रिय कोशिका छँटाई स॑ फायदा छै, लेकिन कुछ मेटाबोलाइट पुस्तकालयऽ क॑ अंतर्निहित स्थिरता आरू/या तेजी स॑ कारोबार दर (22) के कारण प्रभावित होय सकै छै । एकरऽ बावजूद, हमरऽ तरीका दू मान्यता प्राप्त इम्यूनोसप्रेसिव मेटाबोलाइट्स, एडेनोसाइने आरू किनुरेनिन के पहचान करै म॑ सक्षम छेलै, कैन्हेंकि नमूना प्रकार के बीच ई बहुत भिन्न होय ​​छै ।
ट्यूमर आरू टीआईएल उपप्रकार केरऽ हमरऽ मेटाबोनोमिक विश्लेषण स॑ अंडाशय केरऽ टीएमई म॑ मेटाबोलाइट्स के भूमिका के बारे म॑ अधिक जानकारी मिलै छै । सबसें पहलऽ फ्लो साइटोमेट्री के उपयोग करी क॑ हमन॑ ई तय करलकै कि ट्यूमर आरू सीडी 4 + टी कोशिका के बीच माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि म॑ कोनो अंतर नै छै । लेकिन, एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण स॑ ई आबादी के बीच मेटाबोलाइट्स के प्रचुरता म॑ काफी बदलाव के पता चललै, जे ई दर्शाबै छै कि टीआईएल मेटाबोलिज्म आरू ओकरऽ समग्र मेटाबोलिक गतिविधि के बारे म॑ निष्कर्ष निकालै लेली सावधानीपूर्वक व्याख्या करै के जरूरत छै । दोसर, एमएनए मेटाबोलाइट अछि जाहि मे जलन मे सीडी 45-कोशिका आ टी कोशिका मे सबस बेसी अंतर होइत अछि, ट्यूमर मे नहि । अतः, डिब्बाबंदी आरू ट्यूमर केरऽ स्थान केरऽ टीआईएल चयापचय प॑ अलग-अलग प्रभाव पड़॑ सकै छै, जे कोनों देलऽ गेलऽ सूक्ष्म वातावरण म॑ संभावित विषमता क॑ उजागर करै छै । तेसरऽ, एमएनए-उत्पादक एंजाइम एनएनएमटी केरऽ अभिव्यक्ति मुख्य रूप स॑ सीएएफ तलक सीमित छै, जे कम हद तलक ट्यूमर कोशिका छै, लेकिन ट्यूमर स॑ निकललऽ टी कोशिका म॑ पता लगाय सकै वाला एमएनए केरऽ स्तर देखलऽ जाय छै । अंडाशय सीएएफ म॑ एनएनएमटी केरऽ ओवरएक्सप्रेशन केरऽ कैंसर-बढ़ावा वाला प्रभाव एगो ज्ञात छै, जेकरऽ कुछ हद तलक कारण छै सीएएफ चयापचय, ट्यूमर आक्रमण आरू मेटास्टेसिस ( 27 ) केरऽ प्रचार । यद्यपि टीआईएल केरऽ समग्र स्तर मध्यम छै, लेकिन सीएएफ म॑ एनएनएमटी केरऽ अभिव्यक्ति कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) मेसेंकिमल उपप्रकार स॑ गहराई स॑ संबंधित छै, जे खराब पूर्वानुमान स॑ जुड़लऽ छै ( 27 , 46 , 47 ). अंत में, एमएनए केरऽ अपघटन लेली जिम्मेदार एंजाइम एओएक्स१ केरऽ अभिव्यक्ति भी सीएएफ आबादी तलक सीमित छै, जे ई दर्शाबै छै कि टी कोशिका म॑ एमएनए क॑ चयापचय करै के क्षमता के कमी छै । ई परिणाम ई विचार के समर्थन करै छै कि हालांकि ई निष्कर्ष के सत्यापन लेली आरू काम के जरूरत छै, लेकिन टी कोशिका मँ एमएनए के उच्च स्तर इम्यूनोसप्रेसिव सीएएफ सूक्ष्म वातावरण के उपस्थिति के संकेत द॑ सकै छै ।
एमएनए ट्रांसपोर्टर केरऽ कम अभिव्यक्ति स्तर आरू एमएनए चयापचय म॑ शामिल प्रमुख प्रोटीन केरऽ अज्ञात स्तर क॑ देखत॑ हुअ॑ टी कोशिका म॑ एमएनए केरऽ उपस्थिति अप्रत्याशित छै । दू स्वतंत्र समूह केरऽ scRNA-seq विश्लेषण आरू लक्षित qPCR द्वारा न त॑ एनएनएमटी आरू न ही एओएक्स१ केरऽ पता लगाय सकलऽ गेलऽ छेलै । ई परिणाम संकेत करै छै कि एमएनए टी कोशिका द्वारा संश्लेषित नै होय छै, बल्कि आसपास के टीएमई स॑ अवशोषित होय जाय छै । इन विट्रो प्रयोग स॑ पता चलै छै कि टी कोशिका म॑ बहिर्जात एमएनए जमा करै के प्रवृत्ति छै ।
हमरऽ इन विट्रो अध्ययनऽ स॑ पता चललै छै कि बहिर्जात एमएनए टी कोशिका म॑ TNFα केरऽ अभिव्यक्ति क॑ प्रेरित करै छै आरू Sp1 केरऽ TNFα प्रोमोटर स॑ जुड़ाव क॑ बढ़ाबै छै । यद्यपि TNFα केरऽ एंटी-ट्यूमर आरू एंटी-ट्यूमर दूनू कार्य होय छै, लेकिन अंडाशय केरऽ कैंसर म॑ TNFα अंडाशय केरऽ कैंसर केरऽ विकास क॑ बढ़ावा द॑ सकै छै ( 31-33 ). अंडाशय ट्यूमर कोशिका संस्कृति म॑ TNFα केरऽ बेअसरीकरण या माउस मॉडल म॑ TNFα संकेत केरऽ समाप्ति TNFα-मध्यस्थता वाला भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन म॑ सुधार करी सकै छै आरू ट्यूमर केरऽ विकास क॑ रोक॑ सकै छै ( 32 , 35 ). अतः, ऐन्हऽ मामला म॑ टीएमई-व्युत्पन्न एमएनए ऑटोक्राइन लूप के माध्यम स॑ एक TNFα-निर्भर तंत्र के माध्यम स॑ प्रो-इंफ्लेमेटरी मेटाबोलाइट के रूप म॑ काम करी सकै छै, जेकरा स॑ अंडाशय के कैंसर केरऽ घटना आरू प्रसार क॑ बढ़ावा मिलै छै ( 31 ). एहि संभावना के आधार पर, TNFα नाकाबंदी के अध्ययन अंडाशय के कैंसर के लेल संभावित चिकित्सीय एजेंट के रूप में कयल जा रहल अछि ( 37 , 48 , 49 ). एकरऽ अलावा, एमएनए अंडाशय केरऽ ट्यूमर कोशिका केरऽ सीएआर-टी कोशिका केरऽ साइटोटोक्सिसिटी क॑ बिगाड़ै छै, जेकरा स॑ एमएनए-मध्यस्थता वाला प्रतिरक्षा दमन केरऽ आरू सबूत मिलै छै । सामूहिक रूप स॑ ई परिणाम एगो मॉडल के सुझाव दै छै जेकरा म॑ ट्यूमर आरू सीएएफ कोशिका एमएनए क॑ बाह्य कोशिकीय टीएमई म॑ स्रावित करै छै । (i) टीएनएफ-प्रेरित अंडाशय कैंसर विकास उत्तेजना आ (ii) एमएनए-प्रेरित टी सेल साइटोटोक्सिक गतिविधि निरोध के माध्यम सं, एकर दोहरी ट्यूमर प्रभाव भ सकैत अछि (चित्र 5D) ।
निष्कर्षतः, तेजी स॑ कोशिका संवर्धन, एकल-कोशिका अनुक्रमण आरू मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग के संयोजन क॑ लागू करी क॑ ई अध्ययन न॑ एचजीएससी मरीजऽ म॑ ट्यूमर आरू जलन कोशिका के बीच विशाल इम्यूनोमेटाबोलोमिक अंतर के खुलासा करलकै । ई व्यापक विश्लेषण स॑ पता चललै कि टी कोशिका के बीच ग्लूकोज के अवशोषण आरू माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि म॑ अंतर छै, आरू एमएनए क॑ गैर-कोशिका स्वायत्त प्रतिरक्षा नियामक चयापचय के रूप म॑ पहचानलऽ गेलै । ई आंकड़ा केरऽ प्रभाव ई बात प॑ पड़ै छै कि टीएमई मानव कैंसर म॑ टी सेल मेटाबॉलिज्म क॑ कोना प्रभावित करै छै । हालांकि टी कोशिका आरू कैंसर कोशिका के बीच पोषक तत्व के लेलऽ सीधा प्रतिस्पर्धा के रिपोर्ट करलऽ गेलऽ छै, लेकिन मेटाबोलाइट्स ट्यूमर के प्रगति क॑ बढ़ावा दै लेली आरू संभवतः अंतर्जात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया क॑ दबाबै लेली अप्रत्यक्ष नियामक के रूप म॑ भी काम करी सकै छै । ई नियामक मेटाबोलाइट्स केरऽ कार्यात्मक भूमिका केरऽ आगू के वर्णन एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ाबै लेली वैकल्पिक रणनीति खोल॑ सकै छै ।
रोगी कें नमूना आ नैदानिक ​​आंकड़ा कनाडाई ऊतक भंडार नेटवर्क द्वारा प्रमाणित बीसी कैंसर ट्यूमर ऊतक भंडार कें माध्यम सं प्राप्त कैल गेलय. बीसी कैंसर रिसर्च एथिक्स कमेटी आरू यूनिवर्सिटी ऑफ ब्रिटिश कोलंबिया (एच07-00463) द्वारा मंजूर प्रोटोकॉल के अनुसार, सब मरीजऽ के नमूना आरू नैदानिक ​​आंकड़ा न॑ सूचित लिखित सहमति प्राप्त करलकै या औपचारिक रूप स॑ ओकरऽ सहमति माफ करी देलकै । नमूना प्रमाणित बायोबैंक (बीआरसी-00290) मे संग्रहीत कैल जायत छै. रोगी कें विस्तृत विशेषता तालिका S1 आ S5 मे दिखायल गेल छै. क्रायोप्रिजर्वेशन के लेलऽ स्केलपेल के उपयोग रोगी के ट्यूमर के नमूना क॑ यांत्रिक रूप स॑ विघटित करै लेली करलऽ जाय छै आरू ओकरा बाद ओकरा १०० माइक्रोन के फिल्टर स॑ धकेल॑ क॑ एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करलऽ जाय छै । रोगी कें जलन कें 1500 आरपीएम पर 10 मिनट कें लेल 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्रित कैल गेलय ताकि कोशिका कें गोली बनायल जा सकय आ सुपरनेटेंट कें हटा देल जा सकय. ट्यूमर आरू जलन स॑ प्राप्त कोशिका क॑ 50% गर्मी स॑ निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 40% आरपीएमआई-1640 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) आरू 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड म॑ क्रायोप्रिजर्व करलऽ गेलऽ छेलै । ई संरक्षित एकल कोशिका निलंबन क॑ पिघला क॑ मेटाबोलोमिक्स आरू मेटाबोलाइट निर्धारण लेली प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै जेकरऽ वर्णन नीचें करलऽ गेलऽ छै ।
पूरा माध्यम मे 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर 50:50 पूरक आरपीएमआई 1640: AimV शामिल छै. आरपीएमआई 1640 + 2.05 एमएम एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) 10% गर्मी-निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 12.5 एमएम हेपेस (थर्मो फिशर साइंटिफिक), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) फिशर साइंटिफिक), 1 एक्स के साथ पूरक पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनस्ट्रेप) घोल (थर्मो फिशर साइंटिफिक) आ 50 μMB-मर्कैप्टोइथेनॉल। AimV (Invitrogen) कें पूरक 20 mM हेपेस (थर्मो फिशर साइंटिफिक) आ 2 mM एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) छै. फ्लो साइटोमीटर धुंधलापन बफर म॑ 0.22μm फिल्टर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस; इन्विट्रोजन) शामिल छेलै जेकरा म॑ 3% गर्मी-निष्क्रिय एबी मानव सीरम (सिग्मा) के पूरक छेलै । कोशिका संवर्धन बफर 0.22μm छानल पीबीएस सं बनल छै आ 0.5% गर्मी-निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच) सं पूरक छै.
37°C पूर्ण माध्यम म॑ कोशिका क॑ 10 एनएम एमटी डीआर आरू 100 μM 2-एनबीडीजी स॑ 30 मिनट तलक रंगलऽ गेलऽ छेलै । अगिला, कोशिका क॑ 4°C प॑ 15 मिनट तलक व्यवहार्यता डाई eF506 स॑ रंगलऽ गेलऽ छेलै । कोशिका कें एफसी ब्लॉक (ईबायोसाइंस) आ ब्रिलियंट स्टेन बफर (बीडी बायोसाइंसेज) मे पुनः निलंबित करूं, फ्लो साइटोमीटर धुंधला बफर मे पतला करूं (निर्माता कें निर्देशक कें अनुसार), आ कमरा कें तापमान पर 10 मिनट तइक इन्क्यूबेट करूं. कोशिकाअक कें एंटीबॉडी कें एकटा सेट (तालिका S2) सं फ्लो साइटोमेट्री धुंधलापन बफर मे 4°C पर 20 मिनट तइक धुंधला करूं. विश्लेषण स पहिने फ्लो साइटोमेट्री धुंधला बफर (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R विन्यास) मे कोशिका कए पुनः निलंबित करू। सेल गिनती डेटा कें विश्लेषण करय कें लेल स्पेक्ट्रोफ्लो आ फ्लोजो वी10 कें उपयोग करूं, आ डाटा बनावा कें लेल ग्राफपैड प्रिज्म 8 कें उपयोग करूं. 2-एनबीडीजी आरू एमटी डीआर केरऽ मीडियन फ्लोरोसेंस तीव्रता (एमएफआई) क॑ लॉग-सामान्यीकरण करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद मिलान करलऽ गेलऽ मरीजऽ के लेखा-जोखा लेली सांख्यिकीय विश्लेषण लेली एक जोड़ीदार टी परीक्षण के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै । विश्लेषण सं 40 सं कम घटना वाला सबटा आबादी कें हटा देल जाय; सांख्यिकीय विश्लेषण आ डाटा विजुअलाइजेशन करय सं पहिने कोनों नकारात्मक मान कें लेल 1 कें एमएफआई मान दर्ज करय.
उपरोक्त प्रक्रिया पैनल केरऽ मैनुअल गेटिंग रणनीति के पूरक के क्रम म॑, हमन॑ FlowJo म॑ मृत कोशिका क॑ समाप्त करला के बाद स्वचालित रूप स॑ कोशिका क॑ आबादी म॑ असाइन करै लेली आकृति प्रतिबंध ट्री (FAUST) (21) द्वारा पूरा एनोटेशन के प्रयोग करलकै । हम मैन्युअल रूप स॑ आउटपुट क॑ प्रबंधित करी क॑ ऐन्हऽ आबादी क॑ मर्ज करै छियै जेकरा म॑ गलत आवंटन (पीडी१-ट्यूमर कोशिका के साथ पीडी१+ क॑ संयोजन) आरू बरकरार आबादी क॑ विलय करलऽ जाय छै । प्रत्येक नमूना मे औसतन 2% सं बेसि कोशिका होयत छै, कुल 11 आबादी कें लेल.
ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पाद (STEMCELL Technologies) स॑ पीबीएमसी क॑ अलग करै लेली फिकोल ढाल घनत्व अपकेंद्रित्रण के प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । सीडी 8 + टी कोशिका क॑ सीडी 8 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) के उपयोग करी क॑ पीबीएमसी स॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै आरू निर्माता केरऽ निर्देश के अनुसार ट्रांसएक्ट (मिल्टेनी) के उपयोग करी क॑ 2 सप्ताह तलक पूरा माध्यम म॑ विस्तारित करलऽ गेलऽ छेलै । कोशिका क॑ आईएल-7 (10 एनजी/एमएल; पेप्रोटेक) वाला पूरा माध्यम म॑ 5 दिन तलक खड़ा रह॑ देलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद ट्रांसएक्ट स॑ पुनः उत्तेजित करलऽ गेलऽ छेलै । 7म दिन निर्माता केरऽ निर्देश के अनुसार लगातार तीन दौर म॑ कोशिका क॑ समृद्ध करै लेली मानव सीडी४५ माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) के इस्तेमाल करलऽ गेलऽ छेलै । कोशिका क॑ फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण लेली एलिकोट करलऽ गेलऽ छेलै (जैना कि ऊपर वर्णित छै), आरू दस लाख कोशिका क॑ एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण लेली तीन बार एलिकोट करलऽ गेलऽ छेलै । नमूनाक कें एलसी-एमएस/एमएस द्वारा संसाधित कैल गेलय जैना की नीचा वर्णित छै. हम 1,000 के आयन संख्या के साथ गायब मेटाबोलाइट मान के अनुमान लगायल। प्रत्येक नमूना क॑ कुल आयन संख्या (TIC) स॑ सामान्य करलऽ जाय छै, लघुगणकीय रूप स॑ रूपांतरित करलऽ जाय छै आरू विश्लेषण स॑ पहल॑ MetaboAnalystR म॑ स्वचालित रूप स॑ सामान्य करलऽ जाय छै ।
प्रत्येक रोगी कें एकल कोशिका निलंबन कें पिघला क 40 μm फिल्टर कें माध्यम सं पूरा माध्यम (जैना कि ऊपर वर्णित छै) मे छानल गेलय. निर्माता केरऽ प्रोटोकॉल के अनुसार सीडी 8+, सीडी 4+ आरू सीडी 45- कोशिका (बर्फ प॑) लेली नमूना क॑ समृद्ध करै लेली माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) के उपयोग करी क॑ चुंबकीय बीड पृथक्करण द्वारा लगातार तीन दौर के सकारात्मक चयन के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै । संक्षेप म॑ कहलऽ जाय त॑ कोशिका क॑ कोशिका संवर्धन बफर (जैना कि ऊपर वर्णित छै) म॑ पुनः निलंबित करलऽ जाय छै आरू गिनलऽ जाय छै । कोशिका क॑ मानव सीडी 8 बीड्स, मानव सीडी 4 बीड्स या मानव सीडी 45 बीड्स (मिल्टेनी) स॑ 4°C प॑ 15 मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद कोशिका संवर्धन बफर स॑ धोलऽ गेलऽ छेलै । नमूना क॑ एलएस कॉलम (मिल्टेनी) स॑ गुजारलऽ जाय छै, आरू सकारात्मक आरू नकारात्मक अंश एकत्रित करलऽ जाय छै । अवधि क॑ कम करै आरू कोशिका रिकवरी स्टेप क॑ अधिकतम करै लेली, तखन॑ सीडी ८-अंश क॑ सीडी ४+ संवर्धन केरऽ दोसरऽ दौर लेली इस्तेमाल करलऽ जाय छै, आरू सीडी ४-अंश क॑ बाद के सीडी ४५-संवर्धन लेली इस्तेमाल करलऽ जाय छै । अलग करय कें पूरा प्रक्रिया मे घोल कें बर्फ पर राखूं.
मेटाबोलाइट विश्लेषण लेली नमूना तैयार करै लेली कोशिका क॑ एक बार बर्फ-ठंडा नमक के घोल स॑ धोलऽ गेलऽ छेलै, आरू हर नमूना म॑ 1 मिलीलीटर 80% मेथनॉल मिलालऽ गेलऽ छेलै, ओकरा बाद भंवर करी क॑ तरल नाइट्रोजन म॑ स्नैप फ्रीज करलऽ गेलऽ छेलै । नमूना क॑ तीन फ्रीज-थॉ चक्र के अधीन करलऽ गेलै आरू 4°C प॑ 14,000 आरपीएम प॑ 15 मिनट तलक अपकेंद्रित्रित करलऽ गेलै । मेटाबोलाइट्स युक्त सुपरनेटेंट क॑ सूखला तलक वाष्पित करलऽ जाय छै । मेटाबोलाइट्स क॑ 50 μl 0.03% फॉर्मिक एसिड म॑ पुनः घोललऽ गेलै, भंवर स॑ मिलाबै लेली, आरू ओकरा बाद मलबा हटाबै लेली अपकेंद्रित्रित करलऽ गेलै ।
ऊपर वर्णित के अनुसार मेटाबोलाइट्स निकालें | मेटाबोलोमिक्स अनुसंधान कें लेल सुपरनेटेंट कें उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी बोतल मे स्थानांतरित करूं. बैच प्रभाव कें रोकय कें लेल प्रत्येक नमूना कें समान संख्या मे कोशिका सं उपचार करय कें लेल यादृच्छिक उपचार प्रोटोकॉल कें उपयोग करूं. हमनें वैश्विक मेटाबोलाइट्स केरऽ गुणात्मक आकलन करलकै जे पहिने एबी एससीआईईएक्स क्यूट्रैप 5500 ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (50) प॑ प्रकाशित छेलै । मल्टीक्वांट संस्करण 2.1 सॉफ्टवेयर (एप्लाइड बायोसिस्टम्स एससीआईईएक्स) कें उपयोग सं क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण आ पीक एरिया एकीकरण करल गेलय छेलै.
गायब मेटाबोलाइट मान के अनुमान लगाबै लेली 1000 के आयन गिनती के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै, आरू नमूना प्रसंस्करण स॑ वाद्य विश्लेषण द्वारा पेश करलऽ गेलऽ परिवर्तन के सही करै लेली प्रत्येक पता चललऽ मेटाबोलाइट के सामान्यीकृत पीक क्षेत्र के गणना करै लेली प्रत्येक नमूना के टीआईसी के उपयोग करलऽ गेलऽ छेलै । टीआईसी क॑ सामान्य करला के बाद, लघुगणकीय रूपांतरण आरू स्वचालित मानदंड रेखा स्केलिंग लेली MetaboAnalystR(51) (डिफ़ॉल्ट पैरामीटर) के उपयोग करलऽ जाय छै. हमनें नमूना प्रकार के बीच मेटाबोलोम अंतर के अन्वेषणात्मक विश्लेषण करय लेली शाकाहारी आर पैकेज के साथ पीसीए के उपयोग करलकै, आरू मरीजऽ के विश्लेषण करै लेली आंशिक अतिरेक विश्लेषण के उपयोग करलकै. नमूनाक कें बीच यूक्लिडियन दूरी कें समूहबद्ध करय कें लेल हीट मैप डेंड्रोग्राम कें निर्माण कें लेल वार्ड विधि कें उपयोग करूं. हमनें मानकीकृत मेटाबोलाइट प्रचुरता पर लिम्मा (52) के उपयोग पूरा कोशिका प्रकार आरू सूक्ष्म वातावरण भर म॑ विभेदक रूप स॑ प्रचुर मेटाबोलाइट्स के पहचान करै लेली करलकै । व्याख्या क॑ सरल बनाबै के क्रम म॑, हम मॉडल क॑ निर्दिष्ट करै लेली समूह औसत पैरामीटर के उपयोग करय छै, आरू सूक्ष्म वातावरण म॑ कोशिका प्रकार क॑ प्रत्येक समूह (n = 6 समूह) के रूप म॑ विचार करै छियै; महत्व परीक्षण के लेलऽ, हमन॑ हर मेटाबोलाइट के लेलऽ तीन बार-बार मापन करलकै गलत प्रतिकृति स॑ बचै के क्रम म॑ रोगी क॑ लिमा डिजाइन म॑ बाधा के रूप म॑ शामिल करलऽ गेलऽ छेलै । विभिन्न मरीज के बीच मेटाबोलाइट्स के अंतर के जांच के लेल हम मरीज सहित लिम्मा मॉडल के निश्चित तरीका स समायोजित केलहुं। हम कोशिका प्रकार आरू Padj <0.05 (बेंजामिनी-होचबर्ग सुधार) के सूक्ष्म वातावरण के बीच पूर्व-निर्दिष्ट विपरीत के महत्व के रिपोर्ट करय छै.
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% व्यवहार्यता) के उपयोग स॑ जोश संवर्धन के बाद, एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रमण कुल जीवित जमे हुए जलन आरू ट्यूमर नमूना प॑ 10x 5′जीन अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल के उपयोग करी क॑ करलऽ गेलऽ छेलै । मिलान ट्यूमर आ जलन वाला पांच मामला के विश्लेषण करलऽ गेलै, हालांकि एक ट्यूमर नमूना स॑ कम व्यवहार्यता एकरा शामिल नै करी देलकै । रोगी केरऽ कई चयन प्राप्त करै लेली, हमन॑ 10x क्रोमियम नियंत्रक केरऽ लेन म॑ हर मरीज केरऽ नमूना क॑ संयोजित करलकै, आरू जलन आरू ट्यूमर केरऽ जगहऽ के अलग-अलग विश्लेषण करलियै । अनुक्रमण के बाद [Illumina HiSeq 4000 28×98 बीपी युग्मित अंत (पीई), क्यूबेक जीनोम; ट्यूमर आरू जलन के लेलऽ क्रमशः 73,488 आरू 41,378 रीड्स प्रति कोशिका के औसत]], हमन॑ CellSNP आरू Vireo (53) (CelSNP प॑ आधारित के रूप म॑ GRCh38 द्वारा उपलब्ध कराय देलऽ गेलऽ आम मानव एसएनपी (VCF) क॑ एक दाता पहचान सौंपलऽ गेलऽ छै. जलोढ़ आरू ट्यूमर नमूना (54) के बीच दाता के रूप म॑ पहचानलऽ गेलऽ बिना असाइन करलऽ गेलऽ कोशिका आरू कोशिका क॑ छोड़ी क॑ हमन॑ डाउनस्ट्रीम विश्लेषण लेली ट्यूमर आरू जलोढ़ म॑ प्रचुर मात्रा म॑ कोशिका प्रतिनिधित्व के साथ तीन मामला बरकरार रखलकै आरू स्क्रैन (56) बायोकंडक्टर पैकेजिंग म॑ एक द्रव्यमान छाननी चरण के बाद, ई 697 कोशिका पैदा करलकै (2792 आरू 4183 कोशिका, क्रमशः) विश्लेषण के लिए हम अभिव्यक्ति द्वारा समूह कोशिकाओं के लिए जैकार्ड दूरी के आधार पर igraph के (57) Louvain समूहीकरण के उपयोग कर रहे हैं समूहों को मैन्युअल रूप से मार्कर जीन अभिव्यक्ति के आधार पर कथित कोशिका प्रकारों के लिए एनोटेशन किया गया था | सीडी 8 ए आरू जीजेडएमए के अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित, कम राइबोसोमल प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ उपसमूह क॑ छोड़ी क॑ हमन॑ इजर एट अल (16) केरऽ प्रकाशित आंकड़ऽ क॑ एक्सेस करलकै, जेकरा म॑ हुनकऽ टी-एसएनई एम्बेडिंग भी शामिल छै, प्रतिरक्षा कोशिका मार्कर आरू एनएनएमटी अभिव्यक्ति के बीच अभिव्यक्ति ओवरलैप क॑ नियंत्रित करी सकै छै ।
पीबीएमसी क॑ ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पाद (STEMCELL Technologies) स॑ फिकोल ढाल घनत्व अपकेंद्रित्रण द्वारा अलग करलऽ गेलऽ छेलै । सीडी 3 + कोशिका क॑ सीडी 3 बीड्स (मिल्टेनी) के उपयोग करी क॑ पीबीएमसी स॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै । एमएनए केरऽ उपस्थिति या अनुपस्थिति म॑ सीडी 3 + कोशिका क॑ प्लेट-बाउंड सीडी 3 (5μg/ml), घुलनशील सीडी 28 (3μg/ml) आरू आईएल-2 (300 यू/एमएल; प्रोल्यूकिन) स॑ सक्रिय करलऽ गेलऽ छेलै । विस्तार के अंतिम दिन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा व्यवहार्यता (फिक्सेबल वाइबिलिटी डाई eFluor450, eBioscience) आरू प्रसार (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) के मूल्यांकन करलऽ गेलऽ छेलै । गोल्गीस्टॉप के साथ पीएमए (20 एनजी/एमएल) आरू आयनोमाइसिन (1μg/एमएल) के साथ कोशिका क॑ 4 घंटा तलक उत्तेजित करी क॑ प्रभावक कार्य के मूल्यांकन करलऽ जाय, आरू सीडी 8-परसीपी (आरपीए-टी8, बायोलेजेंड), सीडी 4-एएफ700 (आरपीए-टी4) , बायोलेजेंड) आरू टीएनएफα-फ्लोरोसेन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) (एमएबी11, बीडी) के निगरानी करलऽ जाय । पीएमए (20 एनजी/एमएल) आ आयनोमाइसिन (1μg/एमएल) सं qPCR आ चिप कोशिका कें 4 घंटा तइक उत्तेजित करूं. एलिसा सुपरनेटेंट क॑ पीएमए (20 एनजी/एमएल) आरू आयनोमाइसिन (1 μg/ml) स॑ 4 घंटा तलक उत्तेजना स॑ पहल॑ आरू बाद म॑ एकत्रित करलऽ गेलऽ छेलै ।
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) कें उपयोग सं आरएनए कें अलग करय कें लेल निर्माता कें प्रोटोकॉल कें पालन करूं. नमूना कें समरूप करय कें लेल QIAshredder (QIAGEN) कें उपयोग करूं. पूरक डीएनए (सीडीएनए) कें संश्लेषण कें लेल उच्च क्षमता वाला आरएनए टू सीडीएनए किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक) कें उपयोग करूं. निम्नलिखित जांचक कें साथ जीन अभिव्यक्ति (निर्माता कें प्रोटोकॉल कें अनुसार) कें मात्रा निर्धारित करय कें लेल TaqMan रैपिड एडवांस्ड मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक) कें उपयोग करूं: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [हाइड्रोजन (GAPDH) बंद ग्लिसरलडीहाइड-3-फॉस्फेट] आरू Hs01010726_m1 (SLC22A2) । नमूना क॑ माइक्रोएम्प ऑप्टिकल फिल्म के साथ माइक्रोएम्प फास्ट ऑप्टिकल 96-वेल रिएक्शन प्लेट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) म॑ स्टेपवनप्लस रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) प॑ चलाबै के काम करलऽ गेलऽ छेलै । कोनों Ct मान जे 35 सं बेसि होयत छै, ओकरा पता लगावय कें सीमा सं ऊपर मानल जायत छै आ ओकरा पता नहि लगावय कें रूप मे चिह्नित कैल जायत छै.
पहिने वर्णित (58) के अनुसार चिप निष्पादित करू। संक्षेप म॑ कहलऽ जाय त॑ कोशिका क॑ फॉर्मेल्डीहाइड (अंतिम सांद्रता १.४२%) स॑ उपचारित करी क॑ कमरा केरऽ तापमान प॑ १० मिनट तलक इन्क्यूबेशन करलऽ गेलऽ छेलै । 10 मिनट कें लेल बर्फ पर पूरक सूजन बफर (25 एमएम हेपस, 1.5 एमएम MgCl2, 10 एमएम केसीएल आ 0.1% एनपी-40) कें उपयोग करूं, तखन वर्णित (58) कें अनुसार इम्यूनोप्रेसिपिटेशन बफर मे पुनः निलंबित करूं. तखन नमूना कें निम्नलिखित चक्रक कें साथ sonicated कैल गेलय: 10 चक्र (20 1-सेकंड पल्स) आ 40 सेकंड कें स्थिर समय. ChIP-ग्रेड इम्यूनोग्लोबुलिन जी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 1μl), हिस्टोन एच 3 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) आ SP1 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 3μl) एंटीबॉडी कें नमूना कें साथ रात भर 4°CC शेक पर इन्क्यूबेट करूं. प्रोटीन ए बीड्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक) कें नमूना कें साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटा तइक हल्का हिला क इन्क्यूबेट करूं, फेर डीएनए कें समृद्ध करय कें लेल चेलेक्स बीड्स (बायो-रैड) कें उपयोग करूं, आ प्रोटीन पाचन कें लेल प्रोटीनेज के (थर्मो फिशर) कें उपयोग करूं. TNFα प्रोमोटर क॑ पीसीआर द्वारा पता लगाय देलऽ गेलऽ छेलै: आगू, जीजीजी टैट सीसीटी टीजीए टीजीसी टीटीजी टीजीटी; एकरऽ विपरीत, जीटीजी सीसीए एसीए एक्ट जीसीसी टीटीटी एटीए टीजी (207-बीपी उत्पाद) । इमेज लैब (बायो-रैड) द्वारा तैयार करलऽ गेलऽ छेलै आरू इमेजजे सॉफ्टवेयर के उपयोग करी क॑ एकरऽ मात्रा निर्धारित करलऽ गेलऽ छेलै ।
कोशिका संवर्धन सुपरनेटेंट क॑ ऊपर वर्णित तरीका स॑ एकत्रित करलऽ गेलऽ छेलै । निर्धारण मानव TNFα एलिसा किट (Invitrogen), मानव IL-2 ELISA किट (Invitrogen) आरू मानव IFN-γ ELISA किट (Abcam) के निर्माता के प्रक्रिया के अनुसार करलऽ गेलऽ छेलै । निर्माता केरऽ प्रोटोकॉल के अनुसार सुपरनेटेंट क॑ 1:100 पतला करी क॑ TNFα आरू IL-2 के पता लगाय देलऽ गेलऽ छेलै, आरू IFN-γ के पता लगाबै लेली 1:3 । 450 एनएम पर अवशोषण कें माप कें लेल EnVision 2104 मल्टीलेबल रीडर (PerkinElmer) कें उपयोग करूं.
पीबीएमसी क॑ ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पाद (STEMCELL Technologies) स॑ फिकोल ढाल घनत्व अपकेंद्रित्रण द्वारा अलग करलऽ गेलऽ छेलै । सीडी 3 + कोशिका क॑ सीडी 3 बीड्स (मिल्टेनी) के उपयोग करी क॑ पीबीएमसी स॑ अलग करलऽ गेलऽ छेलै । एमएनए केरऽ उपस्थिति या अनुपस्थिति म॑ सीडी 3 + कोशिका क॑ प्लेट-बाउंड सीडी 3 (5μg/ml), घुलनशील सीडी 28 (3μg/ml) आरू आईएल-2 (300 यू/एमएल; प्रोल्यूकिन) स॑ 3 दिन तलक सक्रिय करलऽ गेलऽ छेलै । 3 दिन के बाद कोशिका क॑ एकत्रित करी क॑ 0.9% खारा पानी स॑ धोलऽ गेलै, आरू गोली क॑ स्नैप फ्रीज करी देलऽ गेलै । कोशिका गिनती 123count eBeads के उपयोग स॑ फ्लो साइटोमेट्री (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) द्वारा करलऽ गेलऽ छेलै ।
ऊपर वर्णित के अनुसार मेटाबोलाइट्स निकालें | सूखे अर्क क॑ 4000 कोशिका समकक्ष/μl के सांद्रता म॑ पुनर्गठित करलऽ गेलऽ छेलै । रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी (1290 इन्फिनिटी II, एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) आरू CORTECS T3 कॉलम (2.1×150 मिमी, कण आकार 1.6-μm, छिद्र आकार 120-Å; #186008500, वाटर्स) द्वारा नमूना के विश्लेषण करलऽ जाय । ध्रुवीय मास स्पेक्ट्रोमीटर (6470, एजिलेंट), जेकरा म॑ इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण सकारात्मक मोड म॑ संचालित होय छै । मोबाइल फेज ए 0.1% फॉर्मिक एसिड (H2O मे), मोबाइल फेज बी 90% एसीटोनिट्राइल, 0.1% फॉर्मिक एसिड छै. एलसी ढाल 100% ए कें लेल 0 सं 2 मिनट, 99% बी कें लेल 2 सं 7.1 मिनट, आ 99% बी कें लेल 7.1 सं 8 मिनट छै.तखन मोबाइल चरण ए कें साथ कॉलम कें 3 मिनट कें लेल 0.6 मिलीलीटर/मिनट कें प्रवाह दर सं पुनः संतुलित करूं. . प्रवाह दर 0.4ml/min छै, आरू कॉलम कक्ष क॑ 50°C तलक गरम करलऽ जाय छै । अवधारण समय (आरटी) आरू परिवर्तन (आरटी = 0.882 मिनट, परिवर्तन 1 = 137→94.1, परिवर्तन 2 = 137→92 , रूपांतरण 3 = 137→78) स्थापित करय कें लेल एमएनए कें शुद्ध रासायनिक मानक (M320995, टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी, नॉर्थ यॉर्क, ओंटारियो, कनाडा) कें उपयोग करूं. जखन तीनू संक्रमण सही अवधारण समय पर होयत छै, तखन संक्रमण 1 कें उपयोग मात्रा निर्धारण कें लेल कैल जायत छै ताकि विशिष्टता सुनिश्चित कैल जा सकय. एमएनए (टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी) केरऽ मानक वक्र क॑ स्टॉक घोल (1 मिलीग्राम/एमएल) केरऽ छह सीरियल पतलापन द्वारा उत्पन्न करलऽ गेलऽ छेलै ताकि क्रमशः 0.1, 1.0, 10 आरू 100 एनजी/एमएल आरू 1.0 आरू 10μg/एमएल तरल के मानक प्राप्त करलऽ जाय सक॑ । पता लगाबै के सीमा 1 एनजी/एमएल छै, आरू रैखिक प्रतिक्रिया 10 एनजी/एमएल आरू 10μg/एमएल के बीच छै. नमूना आ मानक कें दू माइक्रोलीटर कें प्रत्येक इंजेक्शन कें उपयोग एलसी/एमएस विश्लेषण कें लेल कैल जायत छै, आ विश्लेषण मंच कें स्थिरता सुनिश्चित करय कें लेल हर आठ इंजेक्शन पर एकटा मिश्रित गुणवत्ता नियंत्रण नमूना चलाएल जायत छै. सब एमएनए-उपचारित कोशिका नमूना के एमएनए प्रतिक्रिया परख के रैखिक सीमा के भीतर छेलै । डाटा विश्लेषण मासहंटर मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (v9.0, एजिलेंट) के उपयोग स॑ करलऽ गेलऽ छेलै ।
दूसरी पीढ़ी के αFR-CAR निर्माण सोंग एट अल स॑ लेलऽ गेलऽ छेलै । (59) के। संक्षेप म॑, निर्माण म॑ निम्नलिखित सामग्री शामिल छै: सीडी ८ए लीडर अनुक्रम, मानव αFR-विशिष्ट एकल-श्रृंखला चर टुकड़ा, सीडी ८ए काज आरू ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र, सीडी २७ इंट्रासेलुलर डोमेन आरू सीडी ३जेड इंट्रासेलुलर डोमेन । पूरा सीएआर अनुक्रम क॑ जेनस्क्रिप्ट द्वारा संश्लेषित करलऽ गेलऽ छेलै, आरू ओकरा बाद ट्रांसडक्शन दक्षता के मूल्यांकन लेली इस्तेमाल करलऽ गेलऽ जीएफपी एक्सप्रेशन कैसेट केरऽ अपस्ट्रीम दूसरी पीढ़ी के लेन्टिवायरस एक्सप्रेशन वेक्टर म॑ क्लोन करलऽ गेलऽ छेलै ।
लेन्टिवायरस HEK293T कोशिका [अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC); दुलबेको कें संशोधित ईगल माध्यम मे उगाएल गेल छै जइ मे 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) आ 1% पेनस्ट्रेप होयत छै, आ CAR-GFP वेक्टर कें उपयोग कैल गेल छै आ पैकेजिंग प्लाज्मिड (psPAX2 आ pMD2.G, Addgene) मे लिपोफेक्शन अमाइन (सिग्मा-एल्ड्रिच) कें उपयोग कैल जायत छै. वायरस युक्त सुपरनेटेंट क॑ संक्रमण के ४८ आरू ७२ घंटा बाद एकत्रित करी क॑ छानलऽ गेलै आरू अल्ट्रासेन्ट्रीफ्यूजेशन द्वारा गाढ़ा करलऽ गेलै । गाढ़ा वायरल सुपरनेटेंट कें -80°C पर संप्रेषण तइक संग्रहीत करूं.
पीबीएमसी क॑ स्वस्थ दाता ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पाद (STEMCELL Technologies) स॑ फिकोल ढाल घनत्व अपकेंद्रित्रण द्वारा अलग करलऽ जाय छै । पीबीएमसी सं सीडी 8+ कोशिका कें अलग करय कें लेल सकारात्मक चयन सीडी 8 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) कें उपयोग करूं. TransAct (Miltenyi) के साथ आरू TexMACS माध्यम म॑ टी कोशिका क॑ उत्तेजित करलऽ जाय [Miltenyi; 3% गर्मी-निष्क्रिय मानव सीरम, 1% पेनस्ट्रेप आ आईएल-2 (300 यू/एमएल) कें पूरक]. उत्तेजना के चौबीस घंटा बाद, टी कोशिका क॑ लेंटिवायरस (10 μl गाढ़ा वायरस सुपरनेटेंट प्रति 106 कोशिका) स॑ ट्रांसड्यूस करलऽ गेलऽ छेलै । साइटेक अरोड़ा (एफएससी (फोरवर्ड स्कैटर)/एसएससी (साइड स्कैटर), सिंगलेट, जीएफपी + पर संप्रेषण कें 1 सं 3 दिन बाद, कम सं कम 30% संप्रेषण दक्षता कें प्रदर्शन करय कें लेल कोशिका कें जीएफपी अभिव्यक्ति कें मूल्यांकन करूं.
CAR-T कोशिका क॑ इम्यूनोकल्ट (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep स॑ पूरक) म॑ 24 घंटा तलक निम्नलिखित परिस्थिति म॑ संवर्धित करलऽ गेलऽ छेलै: बिना उपचारित, 250 μM एडेनोसाइने या 10 mM MNA स॑ उपचारित । पूर्व उपचार के बाद, सीएआर-टी कोशिका क॑ पीबीएस स॑ धोलऽ गेलऽ छेलै आरू 20,000 एसके-ओवी-3 कोशिका [एटीसीसी; मैकॉय 5ए माध्यम (सिग्मा-एल्ड्रिच) मे 10% एफबीएस आ 1% पेनस्ट्रेप कें पूरक 10 पर: 1 कें इफेक्टर सं लक्ष्य अनुपात कें पूरक इम्यूनोकल्ट माध्यम मे तीन प्रति मे प्रवर्धित कैल गेलय. डिजिटलिस सैपोनिन (0.5mg/ml; सिग्मा-एल्ड्रिच) स॑ लाइज करलऽ गेलऽ एसके-ओवी-3 कोशिका आरू एसके-ओवी-3 कोशिका क॑ क्रमशः नकारात्मक आरू सकारात्मक नियंत्रण के रूप म॑ प्रयोग करलऽ गेलऽ छेलै । 24 घंटा कें सह-खेती कें बाद सुपरनेटेंट कें एकत्र कैल गेलय आ निर्माता कें निर्देशक (एलडीएच ग्लो साइटोटोक्सिसिटी परख किट, प्रोमेगा) कें अनुसार लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) कें मापल गेलय. एलडीएच सुपरनेटेंट क॑ एलडीएच बफर म॑ १:५० पतला करलऽ गेलऽ छेलै । हत्या कें प्रतिशत कें मापन निम्नलिखित सूत्र कें उपयोग सं कैल गेलय: हत्या कें प्रतिशत = सुधार कें प्रतिशत / अधिकतम हत्या दर x 100%, जतय सुधार कें प्रतिशत = केवल सह-संस्कृति-टी कोशिका, आ अधिकतम हत्या कें दर = सकारात्मक नियंत्रण-नकारात्मक नियंत्रण.
जैना की पाठ या सामग्री आ विधियक मे वर्णित छै, सांख्यिकीय विश्लेषण कें लेल ग्राफपैड प्रिज्म 8, माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल या आर v3.6.0 कें उपयोग करूं. यदि एकहि रोगी सं अनेक नमूना एकत्रित कैल जायत छै (जैना जलन आ ट्यूमर), त हम एकटा जोड़ीदार टी परीक्षण कें उपयोग करय छी या उचित रूप सं रेखीय या सामान्यीकृत मॉडल मे यादृच्छिक प्रभाव कें रूप मे रोगी कें शामिल करय छी. मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण कें लेल महत्व परीक्षण तीन प्रति मे कैल जायत छै.
एहि लेख के लेल पूरक सामग्री के लेल कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 देखू
ई क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-गैर-व्यावसायिक लाइसेंस के शर्तऽ के तहत वितरित एगो खुला पहुँच वाला लेख छै, जेकरा म॑ कोनो भी माध्यम म॑ उपयोग, वितरण आरू प्रजनन के अनुमति मिलै छै, जब॑ तलक कि अंतिम उपयोग व्यावसायिक लाभ लेली नै छै आरू आधार ई छै कि मूल रचना सही छै । संदर्भ।
नोट: हम अहां सं केवल अपन ईमेल पता देबय लेल कहैत छी जाहि सं अहां जे व्यक्ति के पेज पर सिफारिश करय छी ओकरा पता चलय जे अहां चाहय छी जे ओ ईमेल देखय आओर ई स्पैम नहिं अछि. हम कोनो ईमेल पता कैप्चर नहि करब।
एहि प्रश्नक उपयोग ई परीक्षण करबाक लेल कएल जाइत अछि जे अहाँ विजिटर छी वा नहि आ स्वचालित स्पैम जमा करबा सँ रोकल जाइत अछि ।
मारिसा के किलगौर (मारिसा के किलगौर), सारा मैकफर्सन (सारा मैकफर्सन), लॉरेन जी जकर्याह (लॉरेन जी जकर्याह), अबीगैल एली एरिस जी वाटसन (एच वाटसन), जॉन स्टैग (जॉन स्टैग), ब्रैड एच नेल्सन (ब्राड एच नेल्सन), राल्फ जे डी बेलार्डिनी (राल्फ जे डेबेरडिनिस), रसेल जी जोन्स (रूसेल जी जोन्स), फिनेस टी हैमिल्टन (फिनिस टी।
एमएनए टी कोशिका केरऽ प्रतिरक्षा दमन म॑ योगदान दै छै आरू मानव कैंसर केरऽ इलाज लेली एगो संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य के प्रतिनिधित्व करै छै ।
मारिसा के किलगौर (मारिसा के किलगौर), सारा मैकफर्सन (सारा मैकफर्सन), लॉरेन जी जकर्याह (लॉरेन जी जकर्याह), अबीगैल एली एरिस जी वाटसन (एच वाटसन), जॉन स्टैग (जॉन स्टैग), ब्रैड एच नेल्सन (ब्राड एच नेल्सन), राल्फ जे डी बेलार्डिनी (राल्फ जे डेबेरडिनिस), रसेल जी जोन्स (रूसेल जी जोन्स), फिनेस टी हैमिल्टन (फिनिस टी।
एमएनए टी कोशिका केरऽ प्रतिरक्षा दमन म॑ योगदान दै छै आरू मानव कैंसर केरऽ इलाज लेली एगो संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य के प्रतिनिधित्व करै छै ।
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